袁焰平，任鈺为，江一波，贾启涛，徐亚杰，肖 犟，方 瑞，李其安，赵俊龙，张淑君＊

（1.华中农业大学动物科技学院 农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，湖北武汉430070；2.襄樊正大农牧食品有限公司，湖北襄樊441000）

猪繁殖与呼吸综合征 （Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），又名“猪蓝耳病”，是20世纪80年代末发生的严重危害养猪业的一种新的病毒性性传染病 ，主要引起母猪流产、死胎等繁殖障碍，引发新生仔猪的高致死率及生长猪的呼吸道症状。由于该病具有抗体依赖性增强，免疫抑制，较强基因变异及能在猪体内持续感染等生物学特性，所以很难从根本上控制该病的蔓延，使许多养猪企业和养猪户常常陷入很无奈的境地。然而随着分子生物学技术的快速发展，许多基因已经被发现具有抗病或者抗逆的功能以及大量分子标记被发掘，从而使得抗病育种成为可能。

甘露聚糖结合凝集素（mannan-binding lectin）是由肝细胞合成并分泌的血清蛋白，研究表明，它能够特异性与细菌、病毒表面的糖基结合，并通过MBL（mannan-binding lectin）途径激活补体从而启动机体的天然免疫机制，还具有介导吞噬和免疫调节等作用［1］。在有关人疾病的报道中，一些学者认为MBL基因突变可能直接或者间接导致一些疾病的发生［2］，并已经将MBL-C基因的某些单核苷酸多态性（SNP）作为几种疾病的单倍型标记［3-5］。猪的MBL-C基因位于第14号染色体，是MBL基因家族中的一员，它能够在猪的多种组织器官表达。Lillie B N等［6］推断并验证了猪MBL-C基因启动子的3个SNP突变可能增加了好几种常见传染病的发病几率。

丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶1（dual specificity phosphatase 1，DUSP1）属于一个含有超过10种酶的家族，它们能使目的蛋白中磷酸苏氨酸、磷酸络氨酸和磷酸丝氨酸脱磷酸化，从而使丝裂原活化蛋白激酶（activated protein kinase，MAPK）失活，起到细胞信号调控的作用［7］，DUSP1的优先底物为p38α、-βMAPK以及c-jun氨基端激酶等是在炎症应答过程中起重要作用的物质［8］，对细菌及病毒有一定的抵抗作用。

本实验室利用基因芯片筛选出了一批可能具有猪繁殖与呼吸综合征病毒抗性的SNP位点，基于以上2个基因的抗病作用机理，分别选取MBL-C基因外显子6第296位点A／G突变及DUSP1基因外显子4第308位点C／T突变，利用等位基因特异性PCR（AS-PCR）技术，进行多态性及猪繁殖与呼吸综合征抗病相关性分析，为以后的猪繁殖与呼吸综合征抗病育种提供理论基础及支持。

1 材料与方法

1.1 材料

在安徽某猪场采集98头大约克母猪的尾组织，健康组和猪繁殖与呼吸综合征发病组分别为49头，加酒精运回实验室，置-20℃保存；在湖北某猪场颈静脉采集166头长大母猪的血液，健康组和猪繁殖与呼吸综合征发病组分别为71头和95头，加抗凝剂运回实验室，置-20℃保存。采样的同时统计这些猪的健康状态，以及发病阶段的产仔数据等。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取及AS-PCR反应条件尾组织及血液DNA的提取分别参照Chen H等［9］和张德华等［10］方法。根据 MBL-C基因（GenBank：ENSSSCG00000010427）和DUSP1基因（GenBank：ENSSSCG00000016991）的序列，每个基因分别设计两对引物，引物序列、退火温度及所扩增目的片段大小如表1所示。表中粗斜体字母是人为引入碱基，分别与野生基因型和突变基因型相配对。

20μL PCR反应体系包含：双蒸水15.3μL，10×buffer（含 Mg2＋）2.0μL，5.0mmol／L dNTPs 0.6 μL，10μmol／L上下游引物各0.4μL，TaqDNA聚合酶0.3μL，DNA模板1.0μL。

PCR反应条件为：94℃预变性5min；35个循环（94℃30s，72℃45s）；72℃延伸10min；16℃保存5min，其中各引物退火温度见表1。产物在15g／L琼脂糖凝胶电泳上检测。

1.2.2 数据分析 利用SAS（9.1）软件的对数回归模型（logistic regression models）［11］分析各基因型发病的相对风险度。在95%的置信区间内以其中一种纯合子基因型的发病风险率为参照（reference），即odds ratio（OR）值为1.0，经过该模型分析后，对于另外两种基因型，如果OR值大于1.0，则该基因型具有较大的发病风险（其风险倍数即为OR值），反之亦然；利用该软件的方差分析程序（ANOVA tests）分析各基因型母猪产死仔率（含木乃伊、死胎）的差异性，数据表示方法为：平均数±标准差（±sD）。

表1 MBL-C基因与DUSP1基因引物序列、退火温度及产物片段长度Table 1 The primer sequences，Tm and product sizes of MBL-C gene and DUSP1gene

2 结果

2.1 MBL-C基因与DUSP1基因AS-PCR扩增、基因型分型

2.1.1 MBL-C基因基因分型 对于同一样本，分别用2对引物进行扩增，只有第1对引物扩增出结果的为AA基因型，只有第2对引物扩增出结果的为GG基因型，2对引物均能扩增出结果的为AG基因型（图1），图片中上半部分为第1对引物扩增结果，下半部分为第2对引物扩增结果。

2.1.2 DUSP1基因基因分型 对于同一样本，分别用两对引物进行扩增，只有第1对引物扩增出结果的为TT基因型，只有第2对引物扩增出结果的为CC基因型，2对引物均能扩增出结果的为TC基因型（图2），图片中上半部分为第1对引物扩增结果，下半部分为第2对引物扩增结果。

2.2 2个基因突变点的测序图

2.2.1 DUSP1基因突变点测序 利用表1中引物，随机抽取12个样本按照对应的退火温度进行PCR扩增，将扩增产物混合后直接送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序（图3和图4）。从图4可以看出在第155碱基处存在一个双峰，即该处为T-C突变。

2.2.2 MBL-C基因突变点测序 利用表1中引物，随机抽取12个样本按照对应的退火温度进行PCR扩增，将扩增产物混合后直接送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，PCR产物图和测序图分别见图5和图6。

图1 MBL-C基因AS-PCR扩增结果Fig.1 The results of MBL-C gene by AS-PCR

图2 DUSP1基因AS-PCR扩增结果Fig.2 The results of DUSP1gene by AS-PCR

图3 DUSP1基因测序用PCR产物图Fig.3 PCR products of DUSP1gene for sequencing

图4 DUSP1-EXON4-C308T突变点测序图Fig.4 SNP of DUSP1-EXON4-C308T

图5 MBL-C基因测序用PCR产物图Fig.5 PCR productsof MBL-C gene for sequencing

图6 MBL-C-EXON6-A295G突变点测序图Fig.6 SNP of MBL-C-EXON6-A295G

从图6可以看出，在第94碱基处存在一个双峰，即该处为A-G突变。

2.3 2个基因的突变位点分别在大约克和长大群体中的基因型频率和等位基因频率

从表2可以看出，将MBL-C外显子6第296位点突变进行等位基因频率统计表明，在大约克群体的健康组中，G等位基因占优势，达到0.69，而发病组中A等位基因和G等位基因的频率没有太大差异，分别为0.43、0.57；在长大群体中，无论是健康组还是发病组，G等位基因都是优势基因，其频率分别达到0.75、0.66。利用SAS软件的对数回归模型计算得到：在大约克群体中，AG基因型发病风险率只有 GG基因的0.37倍（OR=0.37，P=0.039），差异达到显著水平，而AA基因型的发病风险率与GG基因型发病风险率的差异性没有达到显著水平（P=0.14）；而在长大群体中，AA基因型发病风险率只有GG基因型的0.11倍（OR=0.11，P=0.04），而AG基因型发病风险率与GG基因型相比，没有达到显著水平（P=0.91）。

从表3可以看出，在两个群体中，无论是发病组还是健康组，T等位基因均为优势基因。利用SAS软件对数回归模型计算认为：在大约克和长大这两个群体中，各基因型发病风险率的差异均没有达到显著水平。

表2 MBL-C基因SNP分别在大约克和长大群体中的基因型频率和等位基因频率Table 2 The frequencies of genotypes and alleles of the SNP in MBL-C gene in Yorkshire and Landrace×Yorkshire populations respectively

表3 DUSP1基因SNP分别在大约克和长大群体中的基因型频率和等位基因频率Table 3 The frequencies of genotypes and alleles of the SNP in DUSP1gene in Yorkshire and Landrace×Yorkshire populations respectively

2.4 2个基因突变点各基因型分别在两个群体中产死仔率的差异性比较

从表4可以看出，MBL-C基因外显子6第296位点突变的各基因型母猪在两个群体中的产死仔率差异没有达到显著水平，但是在长大群体中，AA基因型母猪的产死仔率（0.14）低于AG基因型（0.44）和GG基因型的（0.44）；同样DUSP1基因外显子4第308位点突变的各基因型母猪在两个群体中的产死仔率差异没有达到显著水平，然而在大约克群体中CC基因型母猪的产死仔率（0.27）低于TT基因型（0.51）和 TC基因型的（0.53）。

表4 两个基因突变点各基因型分别在两个群体中产死仔率的差异性比较Table 4 The comparison for the motality of new-born piglets among three genotypes in two SNPs in Yorkshire and Landrace×Yorkshire populations respectively

3 讨论

AS-PCR技术虽然有节约成本、方便快捷等特点，但一个较大的缺点就是容易造成假阴性和假阳性，使结果不太准确。保持3′端与模板严格配对是提高特异性的有效手段，故在引物3′端引入错配碱基是最常用的方法，但是该方法能够降低引物有效延伸从而使扩增效率降低，王瑞恒等认为在3′端第3位或者第4位引入错配碱基能得到较好的扩增效果［14］。所以，本试验也采取了在引物3′端引入错配碱基的方法以提高试验的准确性。

MBL-C基因能够在猪的多种组织器官中表达，其中以肝脏表达量最高，其次是肾脏、小肠和胸腺等器官。有报道称该基因的启动子区第1 081位点GA突变在多种欧洲品种猪中能够影响该基因在肝脏中表达，并且其多态性与猪繁殖与呼吸综合征、肺炎、肠道等疾病有一定的关联性［15-16］。MBL-C基因外显子6第296位点属于同义突变，尽管Phatsara C等［17］研究表明，该位点各基因型间AH50、CH50、C3c等经典补体系统及替代补体系统中关键物质的血清浓度并没有出现显著性的差异。然而我们的研究结果表明在大约克群体中AG基因型具有较小的发病几率；在长大群体中AA基因型具有较小的发病几率，并且在该群体中AA基因型的产死仔率要明显低于AG基因型和GG基因型，所以，我们推测，A等位基因可能为具有抗猪繁殖与呼吸综合征效应的基因。

DUSP1是核磷酸酶，它能够在多种类型细胞及组织中广泛表达，且其表达量受细胞应激、细胞活素类及脂多糖等物理和化学因素的影响。人们发现来自DUSP1基因缺失小鼠的巨噬细胞经脂多糖处理后，P38活化作用能明显增强和延长，且与野生型小鼠相比，DUSP1基因缺失小鼠脂多糖诱导炎症反应要强烈许多［18-21］。DUSP1还能影响巨噬细胞中TNF、IL-6和COX2等炎症基因的表达以及角叉藻聚糖诱导的水肿反应，被认为是通过限制P38 MAPK来实现严重炎症应答的负调节蛋白［22］。虽然该基因被证实与疾病的发生及抵抗有关系，在之前本小组的基因芯片结果中，其外显子第308位点突变各基因型频率在健康猪及猪繁殖与呼吸综合征患猪中呈现出显著差异性，但是在本试验中却未能得到一致的结果，因此不能确定该位点对猪繁殖与呼吸综合征有抵抗作用。

因此，通过本试验，可以认为MBL-C基因外显子6第296位点的A等位基因对猪繁殖与呼吸综合征病毒有一定的抵抗作用，在猪群中可以通过人工选择提高A等位基因的频率，达到提高猪群对猪繁殖与呼吸综合征病毒有抗性能力的目的。

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