潘 旖 姚 瑶 姚炳兴 逯振宇

乌灵菌粉中总黄酮含量测定

潘 旖 姚 瑶 姚炳兴 逯振宇

目的建立乌灵菌粉中总黄酮含量的测定方法。方法采用紫外-可见分光光度法，通过紫外扫描确定最大吸收波长，在最大波长处以芦丁为对照品对总黄酮含量进行测定。结果采用以亚硝酸钠-硝酸铝显色的可见分光光度法在 510nm处测定乌灵菌粉中总黄酮含量，芦丁对照品在 5.5～55μg•ml-1范围内线性关系良好，线性回归方程：y=0.013x－0.0176（r=0.9997），平均回收率为 99.430%（n=6），RSD%为 1.268%。结论采用以亚硝酸钠-硝酸铝显色的可见分光光度法简便，准确可靠，可作为乌灵菌粉中总黄酮的含量测定方法。

乌灵菌粉；黄酮；含量测定

乌灵菌粉是从我国珍稀药用真菌乌灵参中分离获得的菌种，经现代生物工程技术精制而成的纯中药制剂，具有补肾健脑、养心安神的功效，临床多用于治疗失眠，或与西药联合使用治疗抑郁、神经官能症等[1-2]。目前对乌灵菌粉的研究主要集中于氨基酸、多糖以及药理方面等，对乌灵菌粉黄酮含量的测定还尚未见诸报道。本试验采用紫外-可见光分光光度法，对制剂中黄酮含量进行测定，以便更全面地控制其质量。

1 材料与仪器

1.1 试剂芦丁对照品（中国药品生物制品检定所）；乌灵菌粉（浙江佐力药业股份有限公司）；无水乙醇（杭州大方化学试剂厂）；NaOH（河南尔康制药有限公司）；NaNO2（天津博迪化工股份有限公司）；Al（NO3）3（上海振欣试剂厂）。

1.2 仪器UV2550紫外可见光分光光度计（日本岛津）；离心机（上海安亭科学仪器厂）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液的配制精密称取芦丁标准品，用60%乙醇溶解并定容至50ml容量瓶中，配制成0.11mg•ml-1溶液，作为标准液备用。

2.1.2 样品溶液的配制精密称取乌灵菌粉约3g，加90%乙醇100ml，浸泡0.5h，在85℃水浴条件下回流提取2h，抽滤。同法再提取一次，抽虑，合并滤液，减压回收乙醇至仅剩5～7ml为止，置100ml容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，得样品溶液。

2.2 测定方法及波长的选择供试品溶液 3.0ml，置于25ml容量瓶中，加5% NaNO2溶液1.0ml，摇匀，放置6min，加10% Al（NO3）3溶液1.0ml，摇匀，放置6min，加4% NaOH溶液10.0ml，然后用60%乙醇定容至刻度，摇匀，10000r/min离心20min，在波长400～700nm范围内扫描，图谱显示在510nm处有最大吸收峰。以相应试剂为空白，在波长400～700nm范围内扫描，510nm附近未见吸收峰，故选择测定波长为510nm。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察分别精密吸取芦丁对照液0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml于10ml容量瓶中，加5% NaNO2溶液0.3ml，摇匀，放置6min加10% A1（NO3）3溶液0.3ml，摇匀，放置6min加4% NaOH溶液4ml，再用60%乙醇液稀释至刻度，摇匀，10000r/min离心20min置比色皿中，以试剂作空白参比，于510nm处测吸光度。用最小二乘法以吸光度（y）对浓度（x）（μg•ml-1）建立线性回归方程得回归方程：y=0.013x－0.0176（r=0.9997），表明线性关系良好。

2.3.2 精密度试验取同一份对照品溶液，按2.2方法进行处理，510nm处测定吸光度值，连续测定 6次，计算RSD值为0.329%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验取同一份对照品溶液，按2.2方法进行处理，显色后于 10000r/min离心机离心20min后，于离心后0、10、20、30、40、50、60min时测定吸光度，结果表明样品溶液在显色后80min内吸光度稳定。

2.3.4 重复性试验精密称取同一批次过 60目乌灵菌粉3g共6份，按2.2方法进行处理，于510nm处测定吸光度值并计算含量，含量平均值为2.31%，RSD为2.309%，表明重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验精密吸取乌灵菌粉提取液6份于10ml容量瓶中，每份2.5ml（含总黄酮0.075mg），加入与样品中总黄酮含量相等的芦丁对照品，加0.3ml 5% NaNO2，摇匀后静置6min；加0.3mlAL（NO3）3，摇匀后静置6min；加4% NaOH 4ml摇匀后静置6min，加60%乙醇补足至刻度；10000r/min离心20min，于510nm处测定测定吸光度值。计算得平均回收率为 99.430%，RSD%为1.268%（见表1）。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

2.4 样品中总黄酮的含量测定精密称取3份不同批次乌灵菌粉，精密称定，按相同方法制备成溶液，按2.2方法进行处理，于510nm处测定吸光度值，根据回归方程计算总黄酮含量（见表2）。

表2 样品中总黄酮的含量测定结果

3 讨论

本实验应用紫外分光光度法建立测定乌灵菌粉中总黄酮含量的方法。试验曾尝试使用AlCl3显色法以及盐酸-镁粉显色法进行显色，但是AlCl3显色法在350nm处有最大吸收，但极不稳定，空白试剂在350nm 处无最大吸收；盐酸-镁粉法在显色后在285nm处有最大吸收，但未显色的供试品溶液、对照品溶液在280nm处有吸收，可以形成干扰，故未能用于本试验总黄酮含量的测定，最终选择NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法为本试验总黄酮含量测定的显色方法。本实验以芦丁作为对照品，在 510nm处对乌灵菌粉样品进行总黄酮含量测定，结果表明该含量测定方法操作简单、结果准确、回收率高、重复性好，可用于乌灵菌粉总黄酮含量测定及质量控制。

[1] 任少红,王峰,丁静,等.灵芝中总黄酮的含量测定[J].中国科技信息,2009(14)：214.

[2] 张丕奇,孔祥辉,刘佳宁,等.黑木耳中总黄酮提取及含量测定[J].食用菌,2010(4)：71.

Determination of Total Flavone content in WuLing Powder

Pan Yi Yao Yao Yao Bingxing Lu Zhenyu

ObjectiveTo establish a method to determine the content of total flavonoids in Wuling powder.MethodsTotal flavonoids in WuLing Powder were determined at 510nm by ult raviolet spectrophotometry with rutin as standard control.ResultsNaNO2-AL(NO3)3-NaOH colorimetry was used for determination of flavonoids in Wuling powder. The regressive equation was y=0.013x-0.0176(r=0.9997), the recovery was 99.430%(n=6) with RSD was 1.268%.ConclusionThe methods is simple and accurate. It can be used as an quality control method of total flavonoids in Wuling powder.

Wuling mycelia powder; Flavonoids; Content determination

R927.2

A

1673-5846(2013)07-0032-03

浙江佐力药业股份有限公司，浙江湖州 313200