彭振宇 宋玉国 申玉华

苦碟子注射液指纹图谱的研究

彭振宇 宋玉国 申玉华

目的采用 HPLC法建立苦碟子注射液的指纹图谱。方法以绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、菊苣酸混合对照品为参照物；色谱柱Phenomenex Luna C18 4.6mm×250mm，5μm；柱温40℃；检测波长为327nm；以乙腈-0.4%磷酸溶液系统为流动相进行梯度洗脱，流速0.9ml/min。结果30批供试品液相色谱图中，均检出10个特征峰，相似度不低于0.9。结论为苦碟子注射液的质量评价提供了依据。

苦碟子注射液；指纹图谱；高效液相色谱法；木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷

随着对中药注射剂的日益关注，急需建立简便、实用、全面、有效的质量评价体系，中药材从其化学成分角度来讲，是一个具有多种结构类型成分的化合物库，因此仅仅通过控制某一指标性成分的含量而评价成品的整体质量是不充分的。中药指纹图谱技术作为控制和评价中药材、半成品和成品质量的一个有效方法，近年来成为中药质量控制研究的热点，是国际上公认的控制中药材质量的有效手段之一。苦碟子注射液现行国家药品标准采用高效液相色谱法测定腺苷的含量，其中重要的有效成分黄酮类，仅采用紫外分光光度法测定了总黄酮的含量。根据文献报道，苦碟子主要含有三萜、黄酮、倍半萜内酯、核苷、香豆素等成分，其中木犀草素、芹菜素类成分，具有明显扩张冠脉回流量及降低冠脉血管阻力的良好作用，因此，建立以黄酮类化合物为参照的指纹图谱方法，可有效控制产品的内在质量，具有良好的现实意义。苦碟子注射液的有效成分为黄酮类，其中已确定为活性成分的木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷已分离出单体（我所与企业合作），并确定了结构，另外经查阅文献，苦碟子中含有较多有机酸类成分，故我所筛选了一些黄酮类和有机酸类对照品作为参照进行实验，摸索建立以黄酮类化合物为特征峰的指纹图谱测定方法。

1 仪器与试药

岛津 LC-20A高效液相色谱仪；色谱柱：Phenomenex Luna C18（4.6×250mm）。乙腈为色谱纯（Fisher公司）；磷酸为色谱纯（Fisher公司）；甲醇为色谱纯（Fisher公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 参照物溶液的制备取绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、菊苣酸对照品适量，加50%甲醇制成每1ml各含0.05mg混合溶液，即得。

2.1.2 标准提取物溶液的制备取本品约0.1g，置25ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备取样品30批，华夏药业提供的小样4批（编号100621hx、100622hx、100623hx、100624hx），作为供试品，双鼎制药提供了企业自制的标准提取物（简称标提物）。供试品溶液的制备：取本品适量，用0.45μm滤膜滤过，即得。标准提取物制备：取约0.1g，精密称定，至25ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，作为标准提取物溶液。

2.2 色谱条件色谱条件：色谱柱Phenomenex Luna C18 4.6mm×250mm，5μm；流动相A为乙腈，B为0.4%磷酸溶液（ml/min），按表1程序进行梯度洗脱，流速0.9ml/min；检测波长为327nm；柱温40℃。

表1 流动相程序表

2.3 测定波长的选择观察样品各个波长的色谱图，在327nm的色谱图，两个主峰的峰高均较高，两峰比例适中，检出的峰较多，基线比较平整，并且 327nm为有机酸的最大吸收峰，故选择 327nm为测定波长。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验取一份样品按照供试品溶液制备方法制备供试品，在上述色谱条件下连续进样 6次。结果共有峰相对保留时间的 RSD值均小于2.0%，相对峰面积比值均小于3.0%，表明此方法精密度良好。

2.4.2 重复性试验依供试品溶液方法平行配制 6份供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定。结果表明，各共有峰相对保留时间的 RSD值均小于2.0%，各共有峰相对峰面积的RSD值均小于3.0%，表明本方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验取同一份供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h进行测定。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD值均小于2.0%，各共有峰相对峰面积的RSD值均小于3.0%，表明本方法稳定性良好。

2.5 指纹图谱测定测定方法：精密吸取上述各类供测溶液，注入高效液相色谱仪，测定。

2.5.1 保留时间的匹配取上述各类供测溶液的高效液相色谱图，分析及统计，结果在 10～90min，34批供试品共出峰13个，80%以上样品所具有的峰规定为共有峰，共有10个以此作为特征峰，其中对照品相对应的有6个，其余4个相对保留时间分别为0.184±1%、0.279±1%、0.40±1%、1.15±1%处。

2.5.2 相对保留时间匹配以木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷为参比峰，分别计算供试品、参照物、标准提取物中各峰与标准峰保留时间的比值（相对保留时间），结果，30批供试品和4批华夏小样匹配良好，各特征峰的相对保留时间差距极小，34批样品最小、最大值之差最大仅为0.003，相同时间段的参照物、标准提取物的相对保留时间也在此范围内。对最小、最大值与均值之差相对于均值的百分率进行了统计，最大偏移仅为1.087%。

3 结论

将供试品液相色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.1版本），截取保留时间 5～90min图谱，以供试品指纹图谱为参照图谱，设置全谱匹配参数为0（即峰面积占总峰面积的0%以上的峰参加匹配），以2、8、9号峰多点校正，全谱峰匹配，时间窗宽度0.3，原始图谱见图1，匹配后图谱见图 2，生成对照指纹图谱。结果以参照图谱为对照，相似度为0.826～0.998（详见表2），以对照指纹图谱为对照，相似度为0.919～0.998。

表2 分析结果[参照图谱文件名为：16-Detector A(327nm).cdf]

暂定供试品液相色谱图（图3）中，以对照品液相色谱图（图4）为对照，应检出绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、菊苣酸，并且以木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷为标准峰，分别在相对保留时间为0.184±1%、0.279±1%、0.40±1%、1.15±1%处检出峰。将供试品液相色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版本），截取保留时间5～90min图谱，设置全谱匹配参数为0（即峰面积占总峰面积的 0%以上的峰参加匹配），以 2、8、9号峰多点校正，全谱峰匹配，时间窗宽度0.1，计算相似度，不得低于0.90。

图1 原始图谱

图2 匹配后图谱

图3 供试品色谱图

图4 对照品指纹图谱

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Study on HPLC Fingerprint of Kudiezizhusheye

Peng Zhenyu Song Yuguo Shen Yuhua

ObjectiveThe HPLC fingerprints of kudiezizhusheye were established.MethodsUse the chlorogenic acid、caffeic acid、ferulic acid、luteolin-7-O-glucoside、luteolin-7-O-β-D-glucuronopyranoside、cichoric acid as the reference substance;a column of Phenomenex Luna C18 4.6mm×250mm,5μm; Column temperature was 40℃,and 327nm as the detection wavelength; determination was conducted by the gradient elution with acetonitrile and 0.4% phosphoric acid, flow rate at 0.9ml•min-1.ResultsWith 30 batches of test articles, all can detected 10 characteristic peak, the similarity index not less than 0.90.ConclusionThis method can provide basis estimation of quality for kudiezizhusheye.

Kudiezizhusheye; Fingerprints; HPLC; Luteolin-7-O-β-D-glucuronopyranoside

R927.2

A

1673-5846(2013)07-0029-04

吉林省食品药品检验所，吉林吉林 132000