林正豪 曾剑锋 刘国辉

（1 深圳市第三人民医院神经内科，广东 深圳 518112；2 深圳市第三人民医院结核科，广东 深圳 518112）

结核杆菌IFN-γ在结核性脑膜炎鉴别诊断中的应用

林正豪1曾剑锋2刘国辉2

（1 深圳市第三人民医院神经内科，广东 深圳 518112；2 深圳市第三人民医院结核科，广东 深圳 518112）

目的 探讨外周血结核杆菌抗原特异性 γ 干扰素水平在结核性脑膜炎与隐球菌性脑膜炎鉴别诊断中的作用。方法 回顾性分析本院13 例菌阳结核性脑膜炎、15 菌阴结核性脑膜炎及 11 例隐球菌性脑膜炎患者外周血结核杆菌抗原特异性 γ 干扰素水平差异。结果 菌阳结核性脑膜炎患者外周血结核杆菌抗原特异性 γ 干扰素 9 例阳性，4 例阴性，阳性率 69.2%，菌阴结核性脑膜炎患者外周血结核杆菌抗原特异性 γ 干扰素 10 例阳性，5 例阴性，阳性率 66.7%，隐球菌性脑膜炎患者外周血结核杆菌抗原特异性 γ 干扰素 1 例阳性，10 例阴性，阳性率 0.09%，列联表资料的 χ2检验（χ2=6.78，P=0.001），三组阳性率有差别，经组间两两比较，菌阳结核性脑膜炎与菌阴结核性脑膜炎阳性率无显著性差异（χ2=4.31，P=0.07），菌阳结核性脑膜炎与隐球菌性脑膜炎阳性率有显著性差异（χ2=7.37，P=0.013），菌阴结核性脑膜炎与隐球菌性脑膜炎阳性率有显著性差异（χ2=8.26，P=0.024）。结论 外周血结核杆菌抗原特异性 γ 干扰素检测可作为结核性脑膜炎与隐球菌性脑膜炎早期鉴别诊断的辅助手段。

脑膜炎；结核；隐球菌；γ干扰素；诊断

结核性脑膜炎（Tuberculous meningitis，TBM）是肺外结核重症，病死率及致残率均较高，隐球菌性脑膜炎（Cryptococccal neoformans meningitis，CNM）是由新型隐球菌引起的中枢神经系统机会性感染。TBM及CNM患者的临床经过及脑脊液生化改变十分相似，影像学检查缺乏特异性，早期病原检出率低，致使两者鉴别困难，容易误诊[1]。通过酶联免疫斑点技术（Elispot）检测外周血结核分枝杆菌抗原特异性γ干扰素（IFN-γ）在诊断结核菌感染方面具有良好的敏感性及特异性[2]。本文回顾性分析13例菌阳TBM患者、15例菌阴TBM患者及11例CNM患者外周血结核杆菌抗原特异性γ干扰素反应，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

所有病例均为我院2011年1月至2012年8月住院患者，菌阳 TBM组脑脊液抗酸染色或结核分枝杆菌培养阳性，菌阴TBM组典型TBM临床表现、脑脊液改变，脑脊液抗酸染色和结核分枝杆菌培养阴性，经抗结核治疗效果显著，CNM组脑脊液墨汁染色发现隐球菌或脑脊液隐球菌培养阳性。三组患者均无其他器官感染结核杆菌证据。菌阳TBM组13例，男9例，女4例，年龄（27.4±9.1）岁，菌阴TBM组15例，男8例，女7例，年龄（29.4±11.7）岁，CNM组11例，其中男9例，女2例，年龄（25.7±10.1）岁，三组患者性别及年龄分布无明显差异。

1.2 方法

所有病例均抽取乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝血5mL，送实验室行Elispot检测，操作方法参照文献[3]：采血后2h常规分离外周淋巴细胞，在活化后预包被好抗体的平板中，每孔加入100uL，每孔细胞浓度为2×105cells。背景阴性对照空中不加入任何刺激物。阳性对照每孔加入5uL植物血凝素，终极浓度5ug/mL。实验孔分别加入结核菌重组蛋白抗原和合成的结核菌多肽抗原（ESAT-6、PoolA、PoolB），终极浓度均为5ug/mL。然后盖上板盖，放入37oC、5%CO2培养箱16～24h。紧跟2次洗板和加入检测抗体孵育，最后加入显色剂显色。待显色洗板后，Elispot斑点计数，并记录斑点的各种计参数，做统计分析。检测结果根据斑点数量设定，每一个反应孔中斑点数减去阴性孔中斑点数为检测结果，结果≥30为阳性，如果结核菌重组蛋白抗原（ESAT-6）、合成的结核菌多肽抗原A （PoolA）和合成的结核菌多肽抗原B （PoolB）3种抗原中任一种抗原检测结果为阳性，则结果判断为阳性，3种抗原检测结果均为阴性，则结果判断为阴性。

1.3 统计学处理

SPSS13.0统计软件进行统计分析，各组阳性率比较采用列联表资料χ2检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结 果

菌阳结核性脑膜炎患者外周血结核杆菌抗原特异性γ干扰素9例阳性，4例阴性，阳性率69.2%，菌阴结核性脑膜炎患者外周血结核杆菌抗原特异性γ干扰素10例阳性，5例阴性，阳性率66.7%，隐球菌性脑膜炎患者外周血结核杆菌抗原特异性γ干扰素阳性率0.09%，经列联表资料的χ2检验（χ2=6.78，P=0.001），三组阳性率有差别，组间两两比较，菌阳结核性脑膜炎与菌阴结核性脑膜炎阳性率无显著性差异（χ2=4.31，P=0.07），菌阳结核性脑膜炎与隐球菌性脑膜炎阳性率有显著性差异（χ2=7.37，P=0.013），菌阴结核性脑膜炎与隐球菌性脑膜炎阳性率有显著性差异（χ2=8.26，P=0.024）。见表1。

表1 三组外周血结核杆菌抗原特异性γ干扰素检测结果

3 讨 论

TBM与CNM是由不同病原引起的中枢神经系统感染性疾病，二者均呈亚急性或慢性病程，主要表现为头痛、呕吐、发热，颅神经损害，脑膜刺激征阳性，可引出病理反射，二者的颅内压、脑脊液ADA与氯化物含量等可能存在差异[4]，临床上却很难由此将两者鉴别开来，病原学检查仍是重要的鉴别诊断依据，但病原学检查一般比较费时，阳性率低，往往不能及时提供帮助。TBM临床表现复杂，症状多不典型，早期不易确诊[5]。CNM临床上较少见，脑脊液墨汁染色及培养仍是确诊该病的主要手段[6]，患者在脑脊液查及隐球菌之前通常被当成TBM，从而延误治疗，而早期诊断治疗对预后至关重要[7]。故临床上迫切需要新的检测手段来满足二者鉴别，Elispot检测外周血结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ便是近年来发展较快的新一代检测结核病的免疫学诊断技术。

Elispot技术是IFN-γ释放试验中的一种，采用的结核杆菌特异性抗原为ESAT-6和CFP-10，其编码基因位于RD1区，RD1在卡介苗和绝大多数非结核分枝杆菌的基因组中是缺失的，理论上可以避免结核菌素试验中影响特异性的PPD交叉抗原，能够较好地区分真性结核感染和卡介苗接种诱导的反应。在结核杆菌特异性抗原刺激下，测定外周血单个核细胞中能释放IFN-γ的T淋巴细胞数量，从而判断机体是否感染结核[8]，该结果不受卡介苗接种的影响，与非结核分枝杆菌无交叉反应，对结核感染具有良好的诊断价值[2]。本实验应用该技术检测菌阳TBM患者、菌阴TBM患者及CNM患者外周血核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ，结果显示菌阳结核性脑膜炎患者外周血结核杆菌抗原特异性γ干扰素阳性率69.2%，菌阴结核性脑膜炎患者外周血结核杆菌抗原特异性γ干扰素阳性率66.7%，隐球菌性脑膜炎患者外周血结核杆菌抗原特异性γ干扰素阳性率0.09%，三组阳性率有差别（χ2=6.78，P=0.001），组间两两比较，菌阳结核性脑膜炎与菌阴结核性脑膜炎阳性率无显著性差异（χ2=4.31，P=0.07），菌阳结核性脑膜炎与隐球菌性脑膜炎阳性率有显著性差异（χ2=7.37，P=0.013），菌阴结核性脑膜炎与隐球菌性脑膜炎阳性率有显著性差异（χ2=8.26，P=0.024），菌阳及菌阴TBM患者外周血结核杆菌抗原特异性γ干扰素阳性率均较高，CNM患者外周血结核杆菌抗原特异性γ干扰素阳性率较低，当临床上鉴别TBM、CNM困难时，通过Elispot技术检测患者外周血核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ无疑是有益的补充鉴别手段，值得临床推广应用。

临床上诊断为TBM的患者经治疗后，外周血结核杆菌抗原特异性γ干扰素阳性率是否有变化？如有变化，与疗效是否相关？需要进一步研究。

当其他系统感染结核、高龄患者、严重营养不良、免疫缺陷等有可能影响外周血核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ检测结果的准确性，临床分析结果时要综合考虑上述情况。

[1]赵 汝 芬,肖向 莉.新 型 隐 球 菌 性 脑 膜 炎24例 误 诊 分 析 [J].临 床 荟萃,2007,22(7):506-507.

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[5]陈辉,樊治中,张微微.48例结核性脑膜炎临床分析[J].中国热带医学,2011,11(1):102-103.

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Application of Mycobacterium Tuberculosis IFN-γresponses in Differential Diagnosis of Tuberculous Meningitis

LIN Zheng-hao1, ZENG Jian-feng,2, LIU Guo-hui2
(1 Department of Neurology, Shenzhen Third People’s Hospital , Shenzhen 518112, China; 2 Department of Tuberculosis Division, Shenzhen Third People’s Hospital, Shenzhen 518112, China)

ObjectiveTo discuss clinical application of Mycobacterium tuberculosis antigen specific IFN-γresponses in antidiastole between tuberculous meningitis and cryptococal neoformans meningitis.MethodsIFN-γ responses in peripheral blood of 13 patients with csf positive tuberculous meningitis , 15 patients with csf negative tuberculous meningitis and 11 patients with cryptococal neoformans meningitis were tested and then analyzed retrospectively.ResultsPositive IFN-γ responses were detected in 69.2%(9/13)of patients with csf positive tuberculous meningitis, 66.7%(10/15)of patients with csf negative tuberculous meningitis and 9.0%(1/11) of patients with cryptococal neoformans meningitis. IFN-γ responses in the three groups is statistically different(χ2=6.78,P=0.001). Through the comparison between the two two groups, IFN-γ responses positive rate between csf positive tuberculous meningitis patients and csf negative tuberculous meningitis patients is not statistically different(χ2=4.31,P=0.07). IFN-γ responses positive rate between csf positive tuberculous meningitis patients and cryptococal neoformans meningitis patients is statistically different(χ2=7.37,P=0.013). IFN-γ responses positive rate between csf negative tuberculous meningitis patients and cryptococal neoformans meningitis patients is statistically different(χ2=8.26,P=0.024).ConclusionIFN-γresponses in peripheral blood can be used as an assistant means to discriminate cryptococal neoformans meningitis from tuberculous meningitis.

Meningitis ; Tuberculosis; Neoformans; IFN-γ; Diagnosis

R515.2

：B

：1671-8194（2013）10-0004-02

深圳市科技计划项目（编号：201202062）