胡清林* 何泽友 徐成飞 鄢传经 严 海

（成都医学院第一附属医院普通外科一区，四川 成都 610500）

PCR二次扩增法监测乳腺癌微转移的价值探讨

胡清林* 何泽友 徐成飞 鄢传经 严 海

（成都医学院第一附属医院普通外科一区，四川 成都 610500）

目的 探索 PCR 二次扩增法对乳腺癌细胞外周血微转移诊断的应用价值。方法 分离受检者外周血单个核细胞，TRIZOL 液提取总RNA，作 RT-PCR；确认的 cDNA 先作普通 PCR 扩增，再作荧光定量 PCR 扩增。结果 42 例标本有 41 例确认转录为 cDNA，其中乳腺癌 21 例、良性乳腺肿瘤和正常对照各 10 例。经普通 PCR 后再作荧光定量 PCR，乳腺癌 HMAM 表达阳性率为 59%、良性乳腺肿瘤和正常对照均无阳性，乳腺癌组与良性乳腺肿瘤或正常对照组间 hMAM 表达有显著差异。结论 二次 PCR 的灵敏度可成功检出外周血 hMAM 的表达，而单次 PCR 法的灵敏度不够；外周血 hMAM 表达指标可用于监测乳腺癌细胞微转移。

乳腺癌；人乳房珠蛋白；RT-PCR；外周血

乳腺癌发病率呈逐年上升趋势，尽管在早期诊断和综合治疗方面取得了长足发展，但肉眼不可见的肿瘤转移仍严重影响患者的预后。人乳房珠蛋白（human mammaglobin，hMAM）作为与乳腺癌密切相关的蛋白质，在最近才被研究机构发现[1]，若是表达出外周血hMAM阳性，乳腺癌细胞的微转移即高度提示，故此指标特异性价值较高。在临床上，通过外周血对乳腺癌细胞微转移和复发情况进行监测和复发较难，且能实现该监测的方法屈指可数。而外周血微转移癌细胞其表达可以RT-PCR技术实现灵敏检测[2]。本次研究其实验材料为外周血，择取特异的hMAM表达作为定位指标，检测对象为乳腺癌患者，以期探索一条监控乳腺癌细胞外周血微转移的优良临床途径。

1 材料与方法

1.1 临床资料

本次研究纳入病例样本共计42人。其中22人为女性乳腺癌患者，年龄在28～65岁间，平均50.8岁。10人为女性良性乳腺肿瘤患者，年龄在19～63岁间，平均47.2岁。10人为健康女性，年龄在24～63岁间，平均48.9岁。按照病理诊断结果为患者分类。

1.2 试剂仪器

采用上海华美公司生产的的淋巴细胞分离液、TRIZOL总RNA提取液、RT—PCR及PCR反应试剂。采用上海生工生物技术公司生产的DNA marker。委托上海申友生物技术公司合成引物和荧光探针。PTC一200扩增仪系美国产、荧光定量PCR扩增仪系德国产、凝胶成像分析系统系美国GIBCO公司产。综上设备进行本次实验。

1.3 标本配置

在手术前后1日内采集5mL本次所有肿瘤样本患者的外周血，并打入内置EDTA抗凝的一次性管中行hMAM检测。

1.4 总RNA提取

单个核细胞的提取以淋巴细胞分离液实现，而后将核细胞置入Eppendorf管（无RNase）中，以-80℃环境贮存。若需开始检测，应预先取出并化冻。提取总RNA需向管内加TRIZOL液（详细步骤以使用说明书为参考）。

1.5 阳性模板获取

116bp片段的DNA片段系本引物的扩增产物，将这些片段稀释成不同浓度梯度，用作阳性模板。

1.6 RT-PCR验证

RT—PCR Kit的β-actin引物（5’-GCTCGTCGTCGACAACGGCT一3’、5’一CAAACATGATCT—GGGTCATCITCTC-3’）和反应体系扩增β-actin，以确验是否已成功提取总RNA并测定RT-PCR效率。cDNA 5µL含于25µL的总反应体系内，并以普通PCR扩增仪进行扩增处置，扩增条件：94℃ 2min预变性，94℃ 15S、55℃ 30S共40循环，72℃ 1min延伸。在2%的琼脂糖胶中，行扩增产物电泳，明亮条带现于353 bp处判定阳性。

1.7 以实时荧光定量PCR直接检测RT-PCR产物

cDNA产物10µL、Taq酶1µL、PCR buffer 14µL（含一对引物和荧光探针）、合计25µL。以上物质行荧光定量扩增，扩增条件：94℃ 2min预变性，94℃ 5S、60℃ 30S共40循环，37℃ 5 min延伸。行阳、阴性比照对应阳性模板和无菌水。软件自动分析反应后数据，扩增阳性系Ct＜37。

1.8 RT-PCR先行扩增复以实时荧光定量PCR检测

首轮扩增在引物变更为hMAM引物、扩增循环数为25循环的前提下，余参照1.6。次轮荧光扩增处置参照1.7。以首轮产物2µL为模板，无菌水补足总体积至25µL。阴、阳性比照同前。软件自动分析反应后数据，扩增阳性系Ct＜37。1.9 以SPSS 13.0软件行统计学处理。

2 结 果

2.1 验证RT-PCR结果

以1.6实验处置流程、分子量标准参照DNA marker，若明亮条带现于353 bp处判定阳性则判定RT-PCR成功。在共计实验样本42例中，1例呈β-actin阴性，阴性提示RNA已被降解，余为阳性、提示目的cDNA已获取。

2.2 实时荧光定量PCR检测RT-PCR产物结果

参照实验流程1.7，进行阴性和阳性对照均符合，其中2例样本其Ct值起跳于大于37处，但不存在Ct＜37样本。

2.3 RT-PCR先行扩增复以实时荧光定量PCR检测结果参照实验流程1.8，结果见表1。

表1 42例标本hMAM 基因外周血表达的检测结果

3 讨 论

肿瘤复发在癌细胞外周血微转移上有高概率预示。目前在临床上极少有能测出癌细胞外周血微转移的可行性有效方法，故实现外周血乳腺癌微转移的监测异常艰难。荧光定量PCR系统其荧光探针具高度特异性，只结合被扩增的特异性目的片段并同时发出荧光信号，故其灵敏度及特异性价值极高。资料显示[3]，临床多只以常规定性巢式或荧光定量巢式行hMAM cDNA扩增。本次研究的对照方案按照临床主流方案效仿，仅阳性对照呈阳性。虽有2例Ct值＞37时的起跳样本，但皆不呈阳性。若是RT-PCR先行扩增、再以实时荧光定量PCR检测，其hMAM表达在21名乳腺癌患者中，检出59%的阳性率。这清楚地揭示了微转移乳腺癌细胞在外周血中呈极微量，PCR技术纵然具有高灵敏度，hMAM表达的检出仍需行二次扩增。

本次研究结果显示，hMAM表达在乳腺癌组呈59%的阳性率，该结果与良性肿瘤组、健康对照组间差异明显，这说明了RT-PCR在检出外周血中乳腺癌细胞微转移的可行性，也说明hMAM表达指标具特异性。这59%的阳性率，与其他文献相比稍高[3]，这可能因为：①本组外周血样本采集较早，而未经临床处置时患者其血液内所含癌细胞数量较高，采集量自然偏高；②本次研究为普通PCR扩增与实时荧光定量PCR扩增的联合应用，故提升了综合检测的灵敏度，常规检测中本应遗漏的阳性靶向物在本方案中被成功捕捉；③mRNA若受到污染极易降解，本次研究中1例β-actin检测阴性，有很大概率系RNA在提取过程中被降解，其余样本均为β-actin扩增阳性，其cDNA被逆转录得到了确认。为此，部分结果未纳入RT-PCR监控报道结果，而低阳性率有很大概率是因为RNA在前处理时被降解。

综上所述，hMAM表达检测采用二次PCR扩增来提高灵敏度，对乳腺癌细胞的微转移检测效果确切，值得在临床上应用和推广。

[1]Watson MA,Fleming Tp. Mammaglobin a mammary- specific member of the uterglobin gene family is over expressed in human breast cancer[J].Cancer Res,1996,56(4):860-865.

[2]刘宁,张伟,郝希山,等.荧 光定 量聚合酶 链 反 应 检测乳腺 癌外周血微小转移[J].中华普通外科杂志,2002,17(1):38.

[3]韩正祥,张敬川.hMAM mRNA和CEA mRNA RT-PCR检测乳腺癌外周血微转移[J].肿瘤,2004,24(3):273.

R737.9

：B

：1671-8194（2013）10-0082-02

四川省卫生厅面上项目（090119）

*通讯作者：E-mail： lyhqlin@163.com