梁 莉 刘洪臣 鄂玲玲 王东胜

牙周炎是一种口腔常见的细菌感染性疾病，牙周致病菌是通过多种炎性因子和细胞毒性作用产生对牙周组织的破坏性影响，导致牙周组织中的RANKL/RANK/OPG调节系统失衡，最终造成牙周膜、牙槽骨破坏[1]。IL-6是一种多功能的细胞因子具有许多和牙周炎发病机制相关的活性。内皮素-1(endothelin-1，ET-1)作为一种缩血管肽具有多种功能，与各种细胞因子之间存在复杂的联系，研究表明[2]，ET-1与牙周炎的发生有极为密切的关系而且参与了细胞因子的调节，但ET-1在牙周炎发病机制中的作用机理尚不清楚。因此，我们通过研究ET-1对牙周膜细胞IL-6表达的影响，为探讨ET-1在牙周炎发病机制中的作用机理奠定基础，进而为寻求治疗牙周炎提供可能的途径。

1.材料和方法

1.1主要试剂 内皮素-1(sigma，美国),DMEM培养基(Gibco，美国)，胎牛血清(FCS)(浙江金华清湖犊牛利用研究所)，胰蛋白酶(Gibco，美国)，DG-3022型酶联免疫监测仪(南京华东电子仪器厂)。

1.2人牙周膜细胞的培养[3]选取11-13岁因正畸需要而拔除的前磨牙，无菌条件下刮取牙根中1／3的牙周膜组织，剪成1.0mm×1.0mm×1.0mm小块，平铺于25m l培养瓶底，加入含10%FCS的DMEM 培养液，放入CO2孵箱，在37℃、5%CO2、100%湿度条件下培养，倒置显微镜下观察细胞生长情况。待细胞长至培养瓶底约80%时,即可按1∶2传代。弃去原培养基,用PBS洗涤一次,加入0.25%胰蛋白酶及0.2%EDTA 2m l消化。相差显微镜下观察,待大多数牙周膜细胞已收缩变圆且与瓶壁分离(约10m in)，加入含10%胎牛血清DMEM 终止反应。反复吹打后离心(800r/m in,5m in)。调整细胞密度，按4×105/瓶密度接种。取4-8代细胞进行实验。

1.3 ET-1对牙周膜细胞IL-6蛋白的影响 牙周膜细胞按1×105/孔的密度接种于六孔板，培养12h待其贴壁，换无血清DMEM培养基沉默过夜。加入不同浓度(1，10，100nM)的ET-1，以未作任何处理的牙周膜细胞为空白对照。为明确内皮素作用的特异性，培养基内加入ET-1(100nM)，内皮素受体ETA拮抗剂BQ123(100nM)和ETB拮抗剂BQ788(100nM)[4]作阴性对照。12h提取细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书的检测方法进行操作，检测细胞培养上清液中IL-6蛋白水平。

1.4 ET-1对牙周膜细胞IL-6m RNA表达的影响 收集上述各组细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA。本研究采用SYBRGreenⅠ嵌合荧光法对PCR扩增产物做实时定量评估。PCR扩增条件：95℃预变性10 m in；95℃15s，60℃1m in，72℃30s，40个循环；72℃8m in。Applied Biosystem 7500Softw arev 2.0软件分析IL-6与内参GAPDH相对比值，以定量评估IL-6表达水平。合成Real-time PCR引物如下：

IL-6

上游引物：5′-TTGGGACTGATGTTGTTG AC-3′

下游引物：5′-GGCAAATTTCCTGGTTAT ATCC-3′

GAPDH

上游引物：5′-GGAAAGCTGTGGCGTGA T-3′

下游引物：5′-AAGGTGGAAGAATGGGAG TT-3′

1.5统计学处理 实验数据用spssv 13.0统计软件进行分析处理。数据以均数±标准误(M ean±SEM)表示。应用ANOVA检验多个样本均数间差异。设P<0.05为差异具有显著性。

2.结果

2.1 ET-1对牙周膜细胞IL-6蛋白的影响

ELLSA检测结果显示：ET-1(1，10，100nM)剂量依赖性地促进牙周膜细胞IL-6的分泌。与空白对照组相比，ET-1(1，10，100nM)对牙周膜细胞IL-6分泌具有显著的促进作用(P<0.05)(表1，图1)。但加入BQ123(100nM)和BQ788(100nM)后,牙周膜细胞IL-6表达水平与对照组没有明显差异(表1，图2)。内皮素受体ETA拮抗剂BQ123和ETB拮抗剂BQ788可抑制ET-1对牙周膜细胞IL-6分泌的促进效应。

表1 ET-1对牙周膜细胞IL-6蛋白的影响

图1 ET-1对牙周膜细胞IL-6蛋白表达的影响(*P<0.05)

图2 ET受体拮抗剂对牙周膜细胞IL-6蛋白表达的影响(*P<0.05)

2.2 ET-1对牙周膜细胞IL-6m RNA表达的影响 实时定量PCR分析结果显示：与空白对照组相比，ET-1(1nM)处理组牙周膜细胞IL-6m RNA表达无明显改变，ET-1(10或100nM)处理组牙周膜细胞IL-6mRNA表达明显增强(P<0.05)(表2，图3)，ET-1(1，10或100nM)剂量依赖性地促进牙周膜细胞IL-6m RNA表达。而阴性对照组牙周膜细胞IL-6m RNA表达水平与对照组没有明显无差异(表2，图4)，内皮素受体ETA拮抗剂BQ123和ETB拮抗剂BQ788可抑制ET-1对牙周膜细胞IL-6mRNA表达的促进效应。

表2 ET-1对牙周膜细胞IL-6mRNA表达的影响

图3 ET-1对牙周膜细胞IL-6m RNA表达的影响(*P<0.05)

图4 ET受体拮抗剂对牙周膜细胞IL-6mRNA表达的影响(*P<0.05)

3.讨论

一般认为，牙周炎的组织损伤是牙周病原体及其代谢产物诱导的宿主免疫反应引起的，免疫细胞及局部组织细胞(如牙周膜细胞)分泌炎性因子参与这一过程。这些因子在牙周炎的发生和修复过程中也扮演着重要的角色。IL-6是一种多功能的细胞因子,具有许多和牙周炎发病机制相关的活性，在牙周炎症造成的组织破坏过程中起局部调节作用，是炎症反应和免疫应答中十分重要的调节因子[5]。

内皮素(endothelin，ET)是日本学者从猪的主动脉内皮细胞培养的上清液分离纯化的一种血管活性肽，是迄今所知活性最强的血管收缩因子[6]，具有多种功能，与各种细胞因子之间存在复杂的联系，在各种炎症细胞中都有表达。研究发现，ET-1与牙周炎的发生有极为密切的关系[2]。在牙周炎病理过程中，ET-1在炎症牙周组织和细胞中含量显著升高，并参与了细胞因子网络的调节。牙周炎致病菌与ET-1参与牙周炎症有着密不可分的关系[7]。基因多态性分析也表明ET-1基因与成人牙周炎易感性可能存在一定的关系[8]。但内皮素-1在牙周炎发病机制中的作用机理尚不清楚。

在本研究中，我们从蛋白水平和基因水平证实，ET-1可以明显地促进牙周膜细胞IL-6的表达，而且这种促进作用随内皮素-1浓度的增高而逐渐明显。但内皮素受体拮抗剂抑制了ET-1对牙周膜细胞IL-6分泌的促进效应，结果提示ET-1可能是通过上调牙周膜细胞IL-6的表达参与牙周炎的发病过程，通过抑制ET-1的作用可以下调IL-6引发的炎性反应，使用内皮素受体拮抗剂有望成为控制牙周炎的新途径。

因此，本研究发现ET-1可以明显地促进牙周膜细胞IL-6的表达，但内皮素受体拮抗剂抑制了ET-1对牙周膜细胞IL-6分泌的促进效应，这对进一步研究内皮素-1在牙周炎发病机制中的作用机理奠定了基础，进而为寻求治疗牙周炎提供可能的途径。

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[3] 梁 莉，刘洪臣，周 威，等.牙周膜成纤维细胞对成骨细胞细胞数量和碱磷酶活性的影响[J].中华老年口腔医学杂志，2012，10(2)：72-74

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[5] Teles FR,Teles RP,Martin L,et al.Relationships am ong interleuk in-6,tumor necrosis factor-α,adipokines,vitam in D,and ch ronic periodontitis.JPeriodontol，2012，83(9)：1183-1191

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[7] Lester SR,Bain JL,Serio FG,et al.Relationship betw een gingival angiopoietin-1 concentrationsand depth of the adjacent gingival su lcus.J Periodontol，2009，80(9)：1447-1453

[8] Beik ler T,PetersU,Prior K,et al.Geneexpression in periodontal tissues follow ing treatm ent.BMC Med Genom ics，2008，7(1)：30