郭 宏 刘洪臣 顾 斌 黎晓晖 周和平 孙建合 黄靖香 汪爱媛 王 晶

随着人口老龄化的加快，骨质疏松不仅威胁老年人特别是绝经后妇女的健康，而且已成为严重的社会问题。骨质疏松症同许多牙科疾病密切相关，如牙周病的发生，发展及治疗；义齿修复的设计与疗效；正畸治疗；种植义齿修复等等。骨质疏松症已引起多学科医生的高度重视，对于此症的治疗，双膦酸盐类药物是研究最全面，疗效最确切，应用面最广的品种，可用于各种类型的骨质疏松症治疗，其第三代阿仑膦酸钠和利塞膦酸钠等已被证实是理想的最有潜力的防治骨质疏松症首选药物之一。但由于其胃肠道反应较大，长期使用存在过度抑制骨转换的危险，新的更安全高效的治疗骨质疏松的药物仍在研制中。另外，双膦酸盐类药物与其它药物的联合应用，也是目前研究的热点。本实验选择阿仑膦酸钠以及前期研究筛选的左旋精氨酸(10mg/kg)，对已鉴定为建模成功的骨质疏松大鼠单独或联合用药，观察疗效，为临床应用提供基础研究依据。

1.材料方法

1.1材料

1.1.1主要实验试剂 ALN(A lendronate)阿仑膦酸钠(Merck Sharp&Dohm e(Italy)S.P.A.)；L-A rg(L-A rginine)左旋精氨酸(Sigma)；灭菌注射用水；10%中性福尔马林。

1.1.2主要实验仪器 美国通用公司M icroCT(M icro-computerized tomography)扫描机；德国Leica公司骨组织计量学测试仪；美国公司生物力学测试仪；骨组织切片机。

1.2方法

1.2.1药品配制 1.ALN 70mg溶解于灭菌注射用水100m l中，浓度为0.7m g/m l。参照Merck Sharp公司治疗人类骨质疏松症的有效剂量、人与动物给药剂量的换算公式以及其他学者针对大鼠试验的有效剂量，本实验选择70mg/kg,2次/周，皮下给药。

L-A rg 2.5g溶解于灭菌注射用水100m l中，浓度为25mg/m l。

1.2.2实验动物及分组给药 将32只OVX大鼠，8只Sham大鼠，分成Sham组、OVX组、OVX给药组。给予不同药物：ALN、L-A rg、ALN＋L-A rg。ALN组：皮下注射ALN，1.5mg/mg，2天/周。L-A rg组：L-A rg10mg/kg，5天/周。ALN+L-A rg组：皮下注射ALN，1.5mg/mg，2/周；以及L-A rg10m g/kg，5天/周。Sham组和OVX组皮下注射生理盐水。给药时间4周。

1.2.3标本取材、固定 3%戊巴比妥钠(40-50mg/kg)腹腔注射麻醉，眼球后取血，离心，分离血清，冻存。脱颈处死，立即取大鼠一侧股骨、胫骨，去净软组织后，将骨标本置入10%中性福尔马林液中固定。

1.2.4外周血生物化学检验 血标本送解放军总医院生化科检测钙，磷，碱性磷酸酶及骨钙素等。

1.2.5 M icroCT检查 美国通用公司GEeXp lore Locus M icroCT扫描机：voltage 80V，current 450μA， num ber of view s 400， exposure tim e 2000ms，binmode1×1(分辨率)27μm。

(1)胫骨近心干骺端兴趣区进行360°连续断层扫描500层。

(2)胫骨近心干骺端选取约1.8×1.5×1.4mm3区域进行三维重建，分辨率27μm，灰度阈值为1040。

(3)存储胫骨近心干骺端松质骨三维体视计量学参数和骨密度参数。

1.2.6脱钙骨组织病理学检查 ①制备胫骨骨组织脱钙切片；②HE染色；③Masson’s三色法染色。光学显微镜下观察五组切片的胫骨近心干骺端松质骨的结构、形态。主要观察区域为生长板下方约1mm处的次级海绵骨。

1.2.7骨组织计量学测量 胫骨近心干骺端骨组织脱钙切片，HE染色。应用德国徕卡显微系统有限公司Leica DM I 4000B digitalm icroscope及软件IPP Image-Pro Express对骨组织切片进行组织计量学观察。该测量系统由一台光学、荧光显微镜连接着摄像机和电脑，加上骨组织计量学软件组成。将兴趣区拍照后，图像存入电脑；手动测量兴趣区中骨组织周长和骨小梁周长，自动生成骨组织面积和骨小梁面积。

按照如下公式得出松质骨组织计量学计算参数。

(1)骨小梁面积比(%)Tb.A r=Tb.A r/T.A r*100%

(2)骨小梁数目(1/mm2)Tb.N=(1.199/2)*(Tb.Pm/T.A r)

(3)骨小梁分离度(mm)Tb.Sp=(2000/1.199)*(T.A r-Tb.A)/Tb.Pm

比较五组计量学计算参数之间是否有差异。

1.2.8生物力学三点弯曲试验 将冻存于-80℃冰箱的待测股骨于实验前晚上取出，在4℃冰箱过夜。应用美国MTS858M ini Bionix生物力学试验机对大鼠股骨进行三点弯曲试验，跨距2.5cm，加载速度2mm/m in，匀速加载，记录载荷－变形曲线。根据此曲线可以测得最大载荷、最大挠度、弹性载荷、弹性挠度和能量吸收。于股骨断端横截面测得最大外径B和最大内径b、最小外径H和最小内径h，以及皮质骨厚度。应用公式可以计算出股骨的应力和弹性模量等指标。

长骨生物力学参数计算公式：

截面惯性矩(J)(mm4)=л/64×(B×H3-b×h3)

最大应力(N/mm2)=(最大载荷×H×跨距)/(8×惯性矩)(1:100稀释)，保湿，4℃过夜。

(5)拿出后放37℃，30m in,PBS洗涤5m in×3次，加生物素化羊抗兔二抗，37℃，60m in，PBS洗涤5m in×3次。

(6)SABC复合物，37℃，孵育30m in，PBS洗涤5m in×3次。

(7)DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。

(8)在显微镜下观察IGF-1、OC蛋白表达。

1.3统计学分析 数据以均值±标准差表示，应用SPSS13.0One-W ay ANOVA方差分析，组间F检验，两两比较t 检验，P<0.05差异具有显著性。

2.结果

2.1外周血生物化学检验 检测钙，磷，碱性磷酸酶及骨钙素等。

表1 不同药物治疗4周后OVX大鼠骨代谢生化指标比较

弹性应力(N/mm2)=(弹性载荷×H×跨距)/(8×惯性矩)。

弹性模量(E)(N/mm2)=(弹性载荷×跨距3)/(48×弹性挠度×惯性矩)。

弹性能量吸收(N.mm)=0.5×弹性载荷×弹性挠度。

比较五组最大载荷，弹性载荷，最大应力和弹性应力是否存在差异。

1.2.9免疫组织化学检测 采用免疫组织化学染色对胰岛素样生长因子(Insulin-like grow th factor-1,IGF-1)、OC在大鼠股骨组织中的表达进行定位。

(1)石蜡切片经常规脱蜡至水，PBS洗3次。

(2)0.3%TritonX-100，37℃，20m in，PBS洗涤5m in×3次。

(3)5%BSA，37℃，封闭30m in。

(4)倾去封闭血清，加兔抗大鼠IGF-1、OC

如表1所示：大鼠去势后，血清ALP和OC明显升高。三组药物治疗后，两项指标均较OVX组降低，其中ALN+L-A rg组已低至正常值之下，且差异有显著性；ALN组血清ALP下降，接近正常值，OC低至正常值以下；L-A rg组血清ALP下降显著，OC较OVX组略有降低。

2.2 M icroCT检查 胫骨M icroCT三维体视学及骨体积密度结果显示：各项指标组间存在显著性差异。骨体积比、骨小梁数目，ALN组和L-A rg组较OVX组明显升高，且高于Sham组，差异显著。骨小梁厚度，ALN组接近Sham组，而L-A rg组明显高于Sham 组。骨小梁数目，ALN组和L-A rg组较OVX组显著减少，且低于Sham组，差异显著；两种药物合用组，骨小梁分离度与OVX组无显著性差异。骨体积密度，ALN组和L-A rg组明显升高，特别是L-A rg组，但两药合用，骨密度值显著低于单独用药。

表2 不同药物治疗4周后OVX大鼠MicroCT检查

图1 不同药物治疗4周后OVX大鼠胫骨松质骨M icroCT三维重建比较

表3 不同药物治疗4周后OVX大鼠MicroCT检查

2.3脱钙骨组织病理学检查 如图2所示，三组给药组的新生骨基质较Sham组明显增多，骨形成活跃，ALN组尤为突出。两种药物合用组，骨量较单独用药组减少，骨小梁连接性差，分离度大。

图2 不同药物治疗后胫骨松质骨Masson’s3色染色比较

2.4骨组织计量学测量 如表4所示，三组用药组较OVX组骨面积比显著升高，ALN组显著高于Sham组，L-A rg组与Sham组无显著性差异，合用组显著低于Sham组。骨小梁厚度，三组均高于OVX组，与Sham组无显著性差异。但骨小梁数目升高不明显，三组与Sham组均有显著性差异。用药后，骨小梁分离度接近正常或高于正常值。

2.5生物力学三点弯曲试验 如表5图3所示：OVX组最大应力明显降低，差异有显著性，弹性应力也降低，但差异不显著。用药后各项指标均较OVX组升高，其中ALN组最大载荷、弹性载荷显著性高于Sham组，最大应力、弹性应力显著性高于OVX组，与Sham组无显著性差异。L-A rg组和ALN+L-A rg组，最大应力、弹性应力虽比OVX组升高，但无显著性差异。

表4 不同剂量L-Arg应用4周后OVX大鼠胫骨计量学检测指标比较

表5 不同剂量L-Arg应用4周后OVX大鼠股骨三点弯曲试验指标比较

图3 不同药物治疗后载荷、应力比较

2.6免疫组织化学检测 GF-1免疫组化检测显示：OVX 组、L-A rg组IGF-1表达阴性；Sham组IGF-1有表达，主要在骨小梁表面成骨细胞聚集区；ALN组IGF-1表达阳性。

图4 IGF-1的免疫组化染色

图5 骨钙素的免疫组化染色

OC免疫组化检测显示，Sham 组表达阴性；OVX、ALN组有表达，主要在骨髓细胞、骨表面；L-A rg组表达强阳性。

3.讨论

本实验的目的是：实验研究ALN、L-A rg治疗骨质疏松大鼠的效果，初步探讨药物作用机理。实验结果显示：ALN、L-A rg以及联合用药治疗骨质疏松大鼠，疗效肯定但三组间有差异。单独使用ALN或L-A rg疗效好，且两种药物间差异不显著。联合用药不能使两种药物的疗效累加，且不如单独用药。联合用药可能过度抑制骨吸收，骨形成减少。

关于骨质疏松症的治疗，双膦酸盐类药物是研究最全面，疗效最确切，应用面最广的品种，可用于各种类型的骨质疏松症治疗，其第三代阿仑膦酸钠和利塞膦酸钠等已被证实是理想的最有潜力的防治骨质疏松症首选药物之一。双膦酸盐可减少骨吸收，增加网状结构及骨量，增加骨密度，增加幅度在10%-30%。双膦酸盐还可降低骨转换，改善骨小梁微结构提高骨的质量，最终减少骨折的发生率。双膦酸盐药物的作用机理尚不完全清楚。以往研究发现其可能的机理有：1.干扰成熟破骨细胞的功能；2.在骨表面维持足够的浓度梯度，直接影响破骨细胞活化启动的细胞间过程；3.改变使破骨细胞活化的骨基质性质[1-3]。上述三种机理互有联系，均认为双膦酸盐直接作用于破骨细胞。不同的双膦酸盐的药理不尽相同：双膦酸盐与骨结合后，其作用主要由副链决定，阿仑膦酸钠属含氮类双膦酸盐，通过抑制焦磷酸盐合成酶，阻止GPT酶信号蛋白的合成从而抑制破骨细胞功能，还可以改变破骨细胞的功能，包括细胞形态，间断信号，破坏缓冲边界等；除了抑制破骨细胞活性，含氮双膦酸盐还通过抑制破骨细胞募集、黏附，促进凋亡减少细胞寿命从而减少破骨细胞的数量。另外此类药物还通过抑制成骨细胞和骨细胞的凋亡从而增加成骨细胞的数量[4-7]。

观察药物疗效的动物实验，短期研究一般为4周，长期研究为6个月。本实验选择双膦酸盐类药物ALN和一氧化氮供体L－A rg10mg/kg分别单独用药及联合用药治疗骨质疏松大鼠，评价三组药物的短期治疗效果，初步探讨药物的作用机制。

一氧化氮(NO)是重要的信使物质和效应分子，参与体内众多的生理和病理过程。近年来发现，NO在骨代谢及骨质疏松症的治疗中也发挥着重要的作用。cNOS基因敲除动物实验中，由于缺乏必需的NO，骨形成明显缺陷，并对雌激素应答降低。相对高浓度的NO，主要是指上调cNOS表达所产生的NO或由某些NO供体释放产生的略高于正常浓度的NO，往往只表现为对破骨细胞的抑制作用，而对成骨细胞，非但没有抑制作用，反而促进其生成。研究显示，给卵巢切除手术小鼠服用NO供体硝酸甘油，能通过抑制骨吸收和促进骨形成而有效降低小鼠骨丢失，功效与雌激素相当。高浓度的NO，通常指iNOS诱导产生的nmol水平NO，则会抑制成骨细胞和破骨细胞的形成和分化。关于NO在骨代谢中的具体作用机制，目前仍不清楚。Wang等和Fan等都发现，NO的作用可能源于对OPG和RANKL的调节。NO能显著增加OPG的水平并降低RANKL的表达，从而增加骨形成抑制骨吸收。也有研究发现，NO可通过调节碱性磷酸酶ALP调节成骨细胞。现已证实，NO在骨组织中发挥着重要作用，通过调节NOS表达可以调节骨代谢。因此，向骨组织中引入一定量的外源性NO，使之抑制破骨细胞骨吸收的同时，对成骨细胞的增殖不影响或影响较小，有可能达到治疗骨质疏松的作用。这就为研究NO调控剂用于治疗骨质疏松提供了理论基础。目前临床上应用的一些骨质疏松治疗药物，如钙剂、维生素D、双膦酸盐等，虽然取得了一定的疗效，但由于不良反应较多，限制了它们的应用。而一些调控NO且具有抗骨质疏松作用的药物，由于具有多方面的优势，已经开始崭露头角，越来越引起关注。胃肠道反应是现有诸多治疗骨质疏松症药物的常见不良反应，而NO在胃肠道中发挥着与PGs相似的调节粘膜完整性和粘膜血流量的作用，从而能够保护胃肠道免受损伤[8-12]。

血清ALP、OC不仅作为鉴定大鼠骨质疏松模型的一个重要生化指标被选择，在本实验中，同样作为一个重要指标以测定不同药物治疗骨质疏松的效果。ALN使OVX大鼠ALP、OC值显著减少，骨转换降低，表现为抑制骨吸收；L-A rg10mg/kg降低ALP作用强，显著低于Sham组，但OC值降低不明显，与OVX大鼠无显著性差异，显著高于Sham组，提示在抑制骨吸收的同时促进骨形成；ALN和L-A rg10mg/kg联合用药，降低ALP、OC值明显，显著低于Sham组，表现为过度抑制骨转换。三组给药组均呈现低血钙，血磷异常，提示：ALN和L-A rg治疗大鼠骨质疏松症，应注意补钙。

M icroCT三维图像清晰显示三组药物治疗后，ALN组、L-A rg组骨小梁致密，骨量显著增加，高于Sham组；L-A rg组比ALN组效果更显著，骨小梁排列更致密，分离度很小；两种药物联合应用，骨小梁排列不均匀，骨量比OVX组增加，但显著小于分别给药的两组。存储松质骨三维体视计量学参数和骨密度参数，进行统计分析：各项指标组间存在显著性差异；骨体积比、骨小梁数目，ALN组和L-A rg组较OVX组明显升高，且显著高于Sham组；骨小梁厚度，ALN组接近Sham组，而L-A rg组明显高于Sham 组。联合用药组，骨小梁体积比、厚度、分离度与OVX组比无显著性差异，骨小梁数目显著高于OVX组。骨体积密度，ALN组和L-A rg组显著高于Sham组，L-A rg组骨体积密度值尤其高，但两药合用，骨密度值显著高于OVX组，但显著低于单独用药组和Sham组。提示：单独应用ALN和L-A rg治疗大鼠骨质疏松，骨量明显增加，骨小梁结构更致密；联合用药虽有一定疗效，但不如单独用药组。两种药物可能竞争作用靶点，过度抑制骨转换，不适合联合应用。

脱钙骨组织切片检查可以精细观察骨小梁形态和结构的改变，三组给药组的新生骨基质较Sham组明显增多，骨形成活跃，ALN组尤为突出。联合用药组，骨量较单独用药组明显减少，骨小梁连接性差，分离度大。

上述不同检测方法所得结果一致性好，相互印证，相互补充。骨组织切片计量学结果再次验证上述结果。

研究骨量变化的最终目的在于研究骨骼力学强度的变化和再负荷时骨折发生的可能性大小。弹性负荷和最大负荷是反映骨质结构力学特性的有效指标，主要受骨尺寸大小和几何形状的影响。弹性载荷是骨骼在弹性变形阶段所能承受的最大载荷。如果骨骼的弹性载荷值变小，表明骨骼在外力负荷的作用下更容易发生塑性变形，产生不可逆的损伤。最大载荷是骨骼所能承受的极限载荷，如果外力大于最大载荷，骨骼则发生骨折。ALN、L-A rg能显著提高股骨干的最大载荷，说明股骨干抵抗外力负荷的能力提高，塑性变形和骨折的发生率下降。骨材料力学特性反映骨质组成成分及其空间结构变化对骨力学特性的影响。最大应力主要受骨骼有机相质量的影响，弹性应力主要受骨骼无机相质量的影响[13-15]。ALN组大鼠股骨干的最大应力、弹性应力显著高于OVX组，与Sham 组无显著性差异，提示ALN组大鼠股骨的有机相和无机相的质量有所改善，股骨干的材料强度显著提高。L-A rg组最大应力、弹性应力与Sham、ALN组比均无显著性差异，提示L-A rg改善股骨生物力学性能的作用与ALN组相当。骨的力学强度取决于骨的尺寸大小、几何参数和材料强度，换句话说就是，骨的力学强度决定于骨量的多少和骨量的分布及构造。大鼠去除双侧卵巢后，股骨的骨量减少、材料强度下降。理想的防治措施应该是增加骨量的同时提高材料强度，或者是增加骨量的同时不损伤材料强度。本研究表明，阿仑膦酸钠在不改变骨的几何参数的情况下，通过提高骨组织的材料强度而提高骨的力学强度。骨骼的材料强度决定于单位体积内骨量的多少和骨质的排列方式[16-18]。ALN、L-A rg提高骨质疏松大鼠骨组织材料强度的机制可能与以下几个因素有关：1.提高单位体积内的骨量2.改善骨基质的排列结构。骨材料力学强度的提高可能与骨基质的矿化程度升高、矿盐的分布更加均匀、骨基质的排列结构得到改善有关。

细胞因子是一类由多种细胞产生的极微量的、具有广谱生物学活性的小分子多肽。在造血、免疫细胞的发育分化及免疫应答、创伤愈合和再生以及某些细胞的激活过程中具有重要的调节作用。它既不属于免疫球蛋白，也不属于激素[95]。细胞因子分子量较小，在天然免疫和特异性免疫中发挥作用，其生物活性很强，可由多种不同细胞类型产生，细胞因子分泌是个自限性过程，作用方式有自分泌作用(Autocrineaction)，即某类细胞产生的细胞因子可直接作用于该细胞自身；旁分泌作用(Paracrine action)，即某类细胞释放出的细胞因子可作用于邻近的其它细胞。细胞因子必须与细胞表面特异性受体结合，才能发挥作用，具有多重调节作用，细胞因子之间具有相互作用。生长因子中对骨组织最有影响力的是IGF-1，在肝脏中合成后与载体蛋白结合进入血循环。IGF-1是由70个氨基酸组成的具有内分泌、自分泌和旁分泌性的单链多肽。血液中的IGF-1主要由人的肝细胞合成和释放，成骨细胞等也能合成IGF-1。IGF-1具有类似胰岛素的代谢作用；在骨发育和重建过程中，IGF-1还是骨生长重要的自分泌或旁分泌的调节者，用转基因小鼠研究IGF-1基因过度表达和破坏表明IGF-1在产后对长骨生长起重要作用。IGF-1在一生中广泛表达以维持分化的细胞活性，在生长和组织修复时表达增加。由于对IGF-1，IGF-1受体和IGF-BPs的基因结构及对IGF-1作用的认识，IGF-1对临床疾病治疗方面潜在的使用价值正在被认识和进一步研究。在骨质疏松中的治疗作用：研究表明，血清IGF-1水平和骨矿物质含量密切相关，IGF-1水平高者，椎体、股骨颈及腕部的骨密度升高。原发性骨质疏松的病人用外源性GH及IGF-1治疗，骨形成增加，但骨量变化较小，这可能与IGF-1同时刺激骨形成和骨吸收有关[19-23]。

本实验IGF-1免疫组化检测显示：OVX组、L-A rg组IGF-1表达阴性；Sham组IGF-1有表达，主要在骨小梁表面成骨细胞聚集区；ALN组IGF-1表达阳性。提示ALN治疗骨质疏松大鼠，提高骨量、改善骨结构，其作用机制可能有IGF-1参与。OC免疫组化检测显示： Sham 组表达阴性；OVX、ALN组有表达，主要在骨髓细胞、骨表面； L-A rg组表达强阳性，提示L-A rg促进骨形成、显著提高骨矿沉积率。ALN和L-A rg治疗骨质疏松症的作用机制，还需深入研究。相关蛋白组学及分子生物学的研究正在进行中。

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