王文琼 包怡红 蔡秋红 于阳阳

(东北林业大学林学院，哈尔滨 150040)

山核桃(胡桃秋 Juglans mandshurica Maxim，又名核桃、核桃楸、楸子)产自黑龙江小兴安岭海拔500～800 m以下，及东部山区、吉林、辽宁、内蒙古东部、河北、山西等地。山核桃仁中含有丰富的蛋白质、油脂及矿物原元素，含有多种人体必需脂肪酸，对降低人体血清蛋白中的胆固醇、防止动脉粥样硬化和血栓的形成具有积极的作用，广泛应用于食品、医药等领域［1］。

传统提油多采用压榨法和有机溶剂浸出法，这些方法不能充分利用油料中所含的丰富蛋白质，且压榨法产油率低，精制工艺繁琐，油品色泽不理想;有机溶剂浸提法提取时间较长，溶剂挥发损失较多，成本较高，且提油率较低。而超声波辅助提取可提高有效成分的提取率，缩短提取时间，提高提取效率，节省溶剂用量，简化操作步骤［2］。它是利用超声波产生的强烈振动、空化及搅拌等超声效应的协同作用，提高物质分子运动频率和速度，能使植物组织在溶剂中产生空化泡崩溃，使组织细胞破裂，溶剂更容易渗入植物细胞中，加速相互渗透溶解，增加提取物在溶剂中的溶解度。所以在超声波的作用下，无需加热或降低原本加热的温度就能增加物质有效成分的提出率，应用前景十分广阔［3－4］。岳琳等［5］分别采用索氏抽提法、超声波提取法、微波萃取法对新疆和田地区薄皮核桃提取核桃油，并采用气相色谱－质谱法对所得核桃油进行脂肪酸组成分析，结果表明，3种不同的提取方法对核桃油的理化性质有一定影响，但对脂肪酸组成及含量基本无影响。Gravotto等［6］研究表明，超声波辅助提取技术用于油脂类化合物的提取有助于提高出油率，缩短提取时间，并能保证油脂的品质。

本试验采用超声波强化溶剂浸山核桃油油的方法，确定了提取山核桃油油的最佳工艺参数，将超声波技术用于强化油脂浸出提取过程，以提高提油率、缩短提油时间、减少萃取溶剂的用量，简化提取操作步骤，以期改善传统溶剂提取法的不足，寻求新的高效的山核桃仁油提取工艺过程。

1 材料与方法

1.1 试验材料

山核桃:采自牡丹江;石油醚、正己烷、无水乙醇、三氯甲烷、丙酮、冰乙酸、环己烷、盐酸、氢氧化钾:天津市天力化学试剂有限生产;硫代硫酸钠:天津市风船化学试剂有限公司;碘化钾:天津市凯通化学试剂有限公司;可溶性淀粉:天津基准化学试剂有限公司;酚酞:天津市科密欧化学试剂开发中心。

1.2 试验仪器

TDL－40B－W台式低速大容量离心机:湖南南里科科学仪器有限公司;JY92－2 D超声波细胞粉碎仪:宁波新芝生物科技股份有限公司;JA 2003型电子天平:北京赛多利斯仪器系统有限公司;RE－52A型旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂;6890N型气相色谱仪:安捷伦公司。

1.3 试验方法

1.3.1 山核桃仁组成成分测定

含仁率:参照GB 5499—1985;水分及挥发物:参照GB 5528—1985;粗脂肪:参照 GB 5512—1985;粗蛋白:参照GB 5511—1985。

1.3.2 超声波提取工艺流程

山核桃→去壳取仁→粉碎→过筛→称质量→与溶剂混合→超声波处理→离心→取上清液→旋转蒸发→毛山核桃油

1.3.3 试剂的筛选

准确称量已破碎的山核桃仁10.00 g，置于烧瓶中，分别入提取溶剂:正己烷、无水乙醇、石油醚、丙酮、三氯甲烷70 mL，进行超声波辅助处理，设置相同的功率500 W和全程时间为50 min。然后在4 000 r/min条件下离心20 min，取上清液，采用旋转蒸发仪进行浓缩，将浓缩物置鼓风干燥箱中烘干至恒质量，得核桃油，称油质量。

提油率=山核桃油质量/山核桃仁质量×100%

1.3.4 超声波提取山核桃油的单因素试验

1.3.4.1 液料比对山核桃提油率的影响

超声功率500 W，超声时间50 min，设置不同液料比为 5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1(mL∶g)，研究液料比与提油率的关系。

1.3.4.2 超声时间对山核桃提油率的影响

液料比7∶1，超声功率500 W，设置不同超声时间为 20、30、40、50、60、70 min，研究不同超声时间对提油率的影响。

1.3.4.3 超声波功率对提油率的影响

液料比7∶1，超声时间为50 min，设置超声波功率为 200、300、400、500、600、700 W，研究超声功率对提油率的影响。

1.3.5 响应面法优化提取工艺

根据响应面分析法优化超声波提取核桃仁油的工艺参数综合单因素试验结果，确定提取核桃油的液料比(X1)、超声功率(X2)和提取时间(X3)，运用 Design Expert 7.0.0软件程序，根据 Box－Behnken中心组合试验设计原理，采用3因素3水平的响应面分析法，以核桃油的提油率为响应值作响应面，对提取条件进行优化。响应面分析因素与水平见表1。

表1 响应面中心组合试验因素水平表

1.3.6 山核桃油中脂肪酸含量检测

脂肪酸的测定方法为GB/T 17376—2008中酯交换法。

1.3.7 超声波提取山核桃油理化指标测定

对超声波法和超临界萃取法提取的山核桃油进行理化指标检测，对比分析超声波提油效果。相对密度(20℃):GB/T 5526—1985;酸值(mg KOH/g):GB/T 5530—2005;过氧化值(mmol/kg):GB/T 5538—2005;碘值(gI2/100 g):GB/T 5532—1995;皂化值(mg KOH/g):GB/T 5534—1995。

1.3.8 数据处理方法

每个试验重复3次，结果表示为平均值±偏差。运用Design Expert 7.0.0软件程序，进行响应面的设计与分析，画图采用Excel。

2 结果与分析

2.1 山核桃组成成分测定结果

通过测定可知，山核桃含仁率为19.021%，山核桃仁中含水量为4.492%，灰分为2.961%，粗脂肪质量分数为56.42%，粗蛋白质量分数为33.125%。

2.2 不同溶剂对山核桃仁提油率的影响

山核桃仁油的溶剂法提取属于固液萃取过程，过程中的传热传质速率，以及其经济性与溶剂的性质密切相关。试验选用了丙酮、无水乙醇、三氯甲烷、石油醚、正己烷分别提取山核桃仁油，操作参数为:液料比为7∶1(mL∶g)，提取时间50 min，超声波功率500 W，以山核桃提油率为评价指标确定比较理想的提取溶剂。结果如图1所示。

图1 溶剂类型对提油率的影响

从图1可知，正己烷的山核桃油得率为45.54%，比石油醚高5.49%，比丙酮高4.76%，比三氯甲烷高4.01%，而明显高出95%的乙醇。由于石油醚易燃易爆，丙酮有毒性，溶剂残留有害人体健康，不适于工业化生产，且正己烷也是工业提取油脂的常用溶剂。所以用正己烷作为提取山核桃仁油的溶剂［7］。

2.3 液料比对山核桃提油率的影响

称取10.0 g过20目标准筛的山核桃仁，以正己烷为提取溶剂，超声功率500 W，超声时间50 min，选用 5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1(mL∶g)不同液料比，提取山核桃油，液料比的变化对山核桃提油率的影响见图2。

图2 不同液料比对山核桃提油率的影响

图2为液料比对山核桃油提油率的影响曲线。从图2中可看出，随着料液比的减少，也就是溶剂用量的增大，提油率在开始时有明显的提高。这是由于对于一定质量的山核桃仁来说，溶剂用量的增加会降低溶剂中山核桃仁油的浓度，增加了山核桃仁与溶剂接触界面处的浓度差，从而提高了传质速率，在一定时间内提油率增大。当溶剂用量增大一定程度后，由于山核桃仁中的油大部分已被提取出来，再增加溶剂用量，提油率没有明显提高。从经济角度考虑，溶剂用量也不应太大。当其他条件一定时，液料比为7∶1时，提取效果最佳。

2.4 超声时间对山核桃油提取效果的影响

称取10.0 g过20目标准筛的山核桃仁，按液料比7∶1加入提取溶剂正己烷，超声功率500 W，提取时间越长，油脂的提取越完全，但时间过长，提取率升高不大，而且会破坏油脂中的营养成分，故提取时间应从多方面进行综合考虑。本试验对超声提取时间为20、30、40、50、60、70 min 进行探讨，考察超声波时间对提取得率的影响。时间的变化对山核桃提油率的影响如图3所示。

由图3可知，当其他条件一定时，提取时间为50～60 min时，提取效果最好。在提取时间为20～60 min时，提油率随着提取时间的延长而增加，并在60 min时达到最大的提油率;当提取时间为70 min时，提取率有所降低，但基本持平。这可能是由于超声波时间过长反而会导致油脂发生分解反应所致。

图3 不同超声浸提时间对山核桃提油率的影响

2.5 超声功率对提取得率的影响

称量样品10 g，过20目标准筛的山核桃仁，以正己烷为提取溶剂，选用7∶1的液料比，超声时间为50 min，超声功率设为 200、300、400、500、600、700 W提山核桃油，考察超声波功率的变化对提油率的影响，结果见图4。

图4 不同超声功率对山核桃提油率的影响

从图4可以看出，超声波功率在200～600 W范围内，提油率随着功率的增大而增加，这由于超声波功率增加后，超声波强度增强，对山核桃仁的破碎力度增大，进而使提油率上升，功率在600 W时，提油率达到最大，但功率超过600 W，提油率随着功率的增大反而减少。这可能是由于超声波具有无选择性的破坏作用，高功率条件下，空化作用不仅破碎细胞壁，也破坏欲提取物质的分子结构，对于特定的物质，超声波作用的效果取决于超声波巩固率和提取物的结构与性质，不同的提取物有不同的超声功率［8］。因此，本试验条件下最佳超声功率为600 W。

2.6 超声波辅助提取山核桃油工艺条件的优化

根据Box－Benhnken的中心组合试验设计原理，综合单因素影响的试验结果，以液料比(X1)、超声功率(X2)、超声时间(X3)，为自变量，核桃油的提油率为响应值进行3因素3水平的响应面分析试验，优化超声波辅助提取山核桃油的工艺条件。响应面分析方案及试验结果见表2。

采用Design Expert 7.0.0程序对响应值与各因素进行回归拟合后，得到回归方程:

表2 响应面分析方案及试验结果

表3 回归模型方差分析表

模型的可靠性可通过方差分析及相关系数来考察。从表3方差分析结果可知，模型P=0.000 1，表明回归模型极显著，因变量与所有自变量之间的线性关系显著(R2=0.983 0)。失拟项 P=0.740 6＞0.05，模型失拟度不显著。模型的调整确定系数RAdj2=0.961 1，说明该模型拟合程度良好，试验误差小，可用此模型分析和预测超声提取山核桃油的工艺结果。模型的信噪比(Adeq Precision)为21.074，远大于4，说明模型完全可以用来对试验结果进行拟合。

由表3回归模型系数显著性检验结果可知，模型中超声功率X2对山核桃仁提油率的影响极其显著，液料比X1对山核桃仁提油率的的影响显著。在所选的各因素水平范围内，影响超声提取山核桃油的因素主次顺序为:超声功率＞液料比＞超声时间。

利用Design Expert软件对表2数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应面及其等高线见图5～图7。响应面图是响应值Y对试验中的影响因素A、B、C所构成的三维空间图，从该图中可以直观地看出最佳影响因素和各因素之间的交互作用［9］。等高线的形状反映出交互效应的强弱大小，圆形表明两者交互作用不明显，椭圆形表示2个因素交互作用显著［10－11］。

图5 液料比和超声功率对山核桃仁提油率影响的响应曲面和等高线

当超声时间为60 min时，液料比和超声功率对山核桃仁提油率效果的影响见图5。液料比不变时，超声功率在500～700 W范围内，提油率随功率的增加而增加，当超声功率达到一定值后，提油率逐渐下降。超声功率一定时，液料比在6∶1～8∶1(mL∶g)范围内，提油率先逐渐增加，达到最大之后逐渐下降，液料比和超声功率对提油率有交互性影响。当超声功率为600 W时，超声时间和液料比对山核桃仁提油率效果的影响见图6。液料比不变时，超声时间在50～70 min范围内，提油率随时间的增加而增加，当超声时间达到一定值后，提油率逐渐下降。超声时间一定时，液料比在6∶1～8∶1(mL∶g)范围内，提油率先逐渐增加，达到最大之后逐渐下降，超声时间和液料比对提油率有交互性影响。当液料比为7∶1时，超声时间和超声功率对山核桃仁提油率效果的影响见图7。超声功率不变时，超声时间在50～70 min范围内，提油率随时间的增加而增加，当超声时间达到一定值后，提油率逐渐下降。超声功率时，超声功率在500～700 W范围内，提油率先逐渐增加，达到最大之后逐渐下降，超声功率和超声时间对提油率有交互性影响。因此，当其中一种反应物用量一定时，另一种反应用量的变化都会影响反应的进行程度。不适当的配比可能降低反应的发生程度，反而有利于副反应的进行，因此，适当的反应物配比不仅可提高反应程度，而且还可以减少副反应的发生［12］。

根据所建立的数学模型进行参数最佳化分析，得到最优提取条件为:液料比为6.98∶1(mL∶g)，超声波时间为63.92 min，超声波功率为 646.40 W，预测提油率为52.007 2%。为进一步验证响应面分析法所建立的数学模型的显著性，有必要对推断方案进行试验。采用上述条件且取整数，即液料比为7∶1(mL∶g)，超声功率646 W，超声时间为64 min，进行5次重复验证试验，测得提油率为(51.5±0.3)%，与理论预测值相比，相对误差为0.54%左右，因此采用响应面分析法优化得到的提取条件参数准确可靠，具有实用价值。

2.7 山核桃油中脂肪酸含量检测结果

由表4及图8可知，山核桃油中主要含有棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、油酸、亚麻酸，且其出峰顺序为:棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸，其中亚油酸含量最高，其次是油酸、亚麻酸、棕榈酸，不饱和脂肪酸达到90%以上，其中必需脂肪酸亚油酸和亚麻酸占了总量的77%以上。亚油酸是一种ω－6系列的人体必需脂肪酸，是合成花生四烯酸(二十碳四烯酸)的主要原料，是人体合成前列腺素的主要物质，具有防止血栓形成和扩张血管的作用。亚油酸可使低密度脂蛋白降低，高密度脂蛋白升高。低密度脂蛋白易析出胆固醇沉积于血管壁上，造成血管增厚，弹性下降，引起冠心病、中风和动脉瘤等疾病，高密度脂蛋白不仅不易析出胆固醇，还能清除血管壁上沉积的胆固醇，送回肝脏分解。α－亚麻酸一种ω－3系列的脂肪酸，在体内可合成 EPA和 DHA［13－16］。因此，对长期食用饱和脂肪酸含量高的动物油的人们，提倡多食用核桃油，对降低人体血压、降低血清胆固醇有明显疗效，对防止动物粥样硬化、冠状动脉硬化和血栓的形成有着积极的作用，对人体的保健有重要意义［17－19］。

表4 山核桃油脂肪酸组成

图8 山核桃油的气象色谱图

2.8 山核桃油理化性质分析

国家强制性标准规定食用油呈黄色或浅黄色，无异味，酸价＜4.0 mgKOH/g，皂化值180～192 mg/kg，碘值85～105 gI2/100 g，过氧化值不得超过 10 mmol/kg。由表5的理化性质测定结果可知，超声波法提取山核桃油脂的碘价、皂化价、酸价、过氧化值均符合食用油标准，因此采用超声波萃取技术是提取优质纯净山核桃油的较好方法。

表5 超声波提取山核桃油理化性质

3 结论

3.1 响应面分析山核桃油提取过程中的各因素对提油率的影响大小依次为:超声功率＞液料比＞超声时间。

3.2 在本试验条件范围内，建立并验证的回归模型准确有效，可用来分析和预测设定条件范围内及其附近的超声提取山核桃油的工艺结果。

3.3 最优提取条件为:提取溶剂为正己烷，液料比为 7∶1(mL∶g)，超声波时间为 64 min，超声波功率为646 W，在此条件下的提油率达到51.5%，不仅产品得率提高，而且大大降低了生产周期。

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