不同功率超声波对芸豆蛋白理化和功能性质的影响

2012-09-17刘高梅任海伟

中国粮油学报 2012年12期

刘高梅任海伟

(山西轻工职业技术学院轻工化工工程系1，太原 030013)

(兰州理工大学生命科学与工程学院2，兰州 730050)

芸豆(Phaseolus vulgaris Linn.sp.)学名菜豆，是普通菜豆(如小黑芸豆、小白芸豆等)和多花菜豆(如圆奶华芸豆 H、N、D、X等)的总称，属豆科(Leguminosae)菜豆属(Phaseolus L.)的小宗杂粮作物［1］。芸豆蛋白(KBP)中富含天门冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和亮氨酸等氨基酸，其氨基酸评分(AAS)、化学评分(CS)、必需氨基酸指数(EAAI)均高于大豆蛋白或乳清蛋白，必需氨基酸组成符合FAO/WHO标准模式，是一种优质植物蛋白和功能添加剂原料［2］。

蛋白质的功能性质在提高食品品质方面十分重要，蛋白质的功能性质主要由其结构决定。常见的蛋白质改性方法有物理法、生物酶法和化学法等，物理改性是利用热、电、磁、机械能等物理作用形式对蛋白的功能性加以改善，具有费用低、安全性好、作用时间短、对产品营养成分影响较小等优点，应用前景广阔［3］。物理改性方法主要有超声波［4］、超高压［5］、高压脉冲［6］、微波［7］、热诱导聚合［8］等，其中超声波技术具有作用时间短、操作简单易控制及能耗较低等优点，已被用于改善麦胚清蛋白［4］、小麦胚芽球蛋白［9］、大豆浓缩蛋白［10］、小麦面筋蛋白［11］等植物蛋白的功能性质。然而，关于超声波处理对芸豆蛋白理化和功能性质影响的研究尚未见报道。

本试验研究了经不同功率超声波处理前后的KBP紫外光谱、荧光光谱、溶解度、吸油性、起泡性能和乳化性能的变化规律，以期为探索超声波技术改善KBP理化性质和功能性质的方法提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

泾川白芸豆，市售，蛋白质质量分数为22.47%，脂肪质量分数为2.56%(以干基计)。

JY92－2超声波细胞破碎仪:宁波新芝生物科技股份有限公司;TGL－16高速台式冷冻离心机:湘仪离心机厂;Cary50紫外－可见分光光度计:美国瓦里安中国有限公司;FD－1－55冷冻干燥机:北京博医康实验仪器有限公司;960MC荧光光度计:上海精密科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 芸豆蛋白(KBP)的提取

芸豆精选、去皮烘干后粉碎，经石油醚脱脂后过60目筛，低温干燥得芸豆粉。芸豆粉以1∶10(g/mL)的料液比加入蒸馏水，在50℃、pH 9.0条件下恒温搅拌提取1 h，然后3 000 r/min离心20 min，沉淀物再以1∶8(g/mL)比例提取2次。合并3次上清液，用1.0 mol/L HCl调节至pH 4.4，然后4 000 r/min 离心15 min，水洗沉淀 3次，用 0.5 mol/L NaOH 调至pH 7.0，搅拌使沉淀复溶后，倒入透析袋中，4℃下透析48 h后，冷冻干燥，所得产品即为冷冻干燥得到芸豆蛋白［12］。

1.2.2 超声波处理方法

取适量样品溶液，置于超声波细胞破碎仪中处理 5 min，超声波功率分别为 100、200、300、400、500、600 W，处理后的样品进行理化性质和功能性质分析。

1.2.3 紫外光谱扫描

准确称取0.5 g KBP溶于600 mL蒸馏水中，搅拌均匀，5 000 r/min离心5 min后取上清液进行超声波处理，处理后的样品在200～800 nm范围用紫外－可见分光光度计扫描。

1.2.4 荧光光谱扫描

准确称取0.5 g KBP溶于600 mL蒸馏水中，搅拌均匀，5 000 r/min离心5 min后取上清液进行超声波处理，处理后的样品用荧光分光光度计扫描，扫描条件为激发波长380 nm，发射波长400～800 nm。

1.2.5 功能性质的测定

1.2.5.1 溶解度的测定

配制1%的蛋白溶液，室温搅拌30 min，然后3 000 r/min离心20 min，用半微量凯氏定氮法测定上清液中的蛋白质浓度。溶解度表示为上清液蛋白质浓度占总蛋白质浓度的比例［13］。

1.2.5.2 起泡性能的测定

配制2%的蛋白溶液，在10 000 r/min条件下搅打1 min，迅速倒入500 mL量筒中，泡沫体积记为起泡性。静置10 min后，再次测量泡沫体积，记为泡沫稳定性［11］。

1.2.5.3 乳化性能的测定

配制3%的蛋白溶液50 mL，调节至pH 7.0，在12 000 r/min条件下室温均质30 s，加入50 mL大豆油，再均质2 min，迅速将乳化液倒入2个50 mL的离心管中，2 700 r/min离心5 min，测量乳化层体积。上述方法所得混合液80℃保温30 min，冷却至室温后2 700 r/min离心5 min，取出后测量乳化层体积［14］。计算乳化性(EA)和乳化稳定性(ES)。

1.2.5.4 吸油性的测定

称取0.5 g蛋白(精确到0.001)和10 mL大豆油于离心管中混匀，室温静置30 min，然后8 000 r/min离心30 min，测定上清液体积，体积减少量即为样品吸油量。吸油性表示为每克样品吸附油的体积［15］。

1.3 数据处理

试验数据均进行3次重复试验，并取平均值。

2 结果与分析

2.1 超声波处理对KBP 紫外光谱的影响

蛋白质产生紫外吸收主要是由于色氨酸和酪氨酸残基侧链基团对紫外光的吸收，其次是苯丙氨酸、组氨酸和半胱氨酸残基侧链基团以及肽键对紫外光的吸收［16］。超声波处理对KBP紫外光谱的影响如图1所示。由图1可知，当超声波功率≤500 W时，超声波处理后的KBP紫外吸光度均出现了不同程度降低。这可能是因为，蛋白分子中二硫键的增加或巯基的减少，导致蛋白分子折叠，蛋白表面生色基团的减少引起紫外吸光度降低，这说明经超声波处理后的KBP空间结构发生了变化。当超声功率为600 W时，紫外吸光度明显高于未处理组(0 W)，随着超声波功率的提高，蛋白肽链伸展开来，从有序的折叠态变为无序的去折叠态，以致本来被包含在内部的色氨酸和酪氨酸残基的疏水基团裸露，使吸收强度增加［17］。

图1 超声波功率对芸豆蛋白紫外光谱的影响曲线

2.2 超声波处理对KBP荧光光谱的影响

超声波处理对KBP荧光光谱的影响如图2所示。由于KBP中色氨酸和酪氨酸的存在使其具有内源荧光，在380 nm激发波长下，KBP的最大发射波长为560 nm。KBP经超声波处理后，荧光光谱的最大发射峰稍有蓝移，荧光强度减弱或增强，但峰形未变，表明超声波处理没有破坏蛋白质的一级结构，仅使疏水腔结构和发色团的微环境发生了不同程度的改变，疏水性增强。当超声波功率在100～500 W范围内，经超声波处理的KBP荧光强度明显低于未处理组(0 W);超声波功率为600 W时的KBP荧光强度则高于未处理组(0 W)。由图2还可看出，随着超声功率的提高，激发荧光强度逐渐增加。因为，随着功率的增加，超声波对介质产生的空穴效应、机械效应和超混合效应等作用增强，促使蛋白分子伸展，暴露出不同的生色基团，从而改变了荧光强度的大小。另外，蛋白分子整体结构复杂、芳香族氨基酸和荧光生色基团分布不均、蛋白分子伸展或折叠方式不同，在超声处理下都会引起蛋白荧光强度的差异［18］。

图2 超声波功率对芸豆蛋白荧光光谱的影响

2.3 超声波处理对KBP溶解度的影响

蛋白质的溶解性与功能特性存在密切联系，通过蛋白质的溶解性来体现其他的功能特性。因此，溶解度是蛋白的重要功能特性之一［19］。由图3可知，当超声波功率在0～300 W范围内，KBP溶解度与超声波功率呈正相关关系，当超声波功率大于300 W时，溶解度增幅变缓，渐趋平稳。因为，一方面，KBP中的谷氨酸、天冬氨酸和丝氨酸含量较高，经超声波处理后，其分子发生了伸展，这些氨基酸的充分暴露有利于溶解度的提高。另一方面，蛋白质中的自由氨基群能和邻近羧基群发生静电引力，使蛋白分子聚集，溶解度下降;超声波处理能够打断自由氨基群和邻近羧基群之间的联系，使溶解度得到提高［9］。再者，超声波产生的空化效应和机械效应打开蛋白聚集体的同时打断了蛋白质分子的四级结构，形成溶于水的非共价键分子，与溶剂水的相互作用力加强，使其溶解度增加［20］。上述综合作用，使得蛋白质中的亲水性氨基酸残基向蛋白质外部迁移，致使蛋白质水合能力加强，溶解度提高。

图3 超声波功率对芸豆蛋白溶解度的影响

2.4 超声波处理对KBP起泡性能的影响

由图4可知，随着超声波功率的增加，KBP的起泡性和起泡稳定性呈先增后减的趋势，当超声波功率为500 W时，起泡性和起泡稳定性达到最大，分别134.5%和146.8%。一方面，超声波处理改变了KBP的表面疏水性，而表面疏水基团能够促进形成水－空气界面;同时，表面疏水性增加意味着蛋白分子发生了伸展，而适度伸展的蛋白分子间能形成更为稳定的网络结构和界面膜，使超声波处理后KBP的起泡性能增强。另一方面，当超声波功率进一步增大时，KBP分子表面疏水性降低，这样由蛋白分子间相互作用形成的稳定网络结构和界面膜遭到破坏，产生的泡沫界面膜由于缺乏韧性而容易破裂，导致KBP的起泡性和起泡稳定性开始下降［4］。

图4 超声波功率对芸豆蛋白起泡能力研究

2.5 超声波处理对KBP乳化性能的影响

蛋白质分子的两亲结构使其在油水混合液中可以扩散到油水界面形成油水乳化液，在油滴周围形成一层膜，避免脂肪的聚集，蛋白质促使油和水形成乳化液，并保持乳化液稳定的能力即为蛋白质的乳化特性。由图5可知，随着超声波功率的增加，KBP的乳化性和乳化稳定性逐渐增加，但功率超过500 W时，乳化性和乳化稳定性反而下降。这是因为，一方面，当超声波功率增大时，声强增大，蛋白质溶液受到的负压也随之增大，水分子间平均距离就会增大，超过极限距离后，蛋白质结构的完整性被破坏，造成空穴，蛋白质分子的结构变得疏松，乳化能力及乳化稳定性得到提高。当功率继续增大，蛋白质变性增大，超声波显现出强烈的机械性断键作用，不溶性蛋白质含量增多，乳化性能随之降低［21］。另一方面，蛋白质的乳化性能与其表面疏水性存在一定关系，低功率超声有利于蛋白分子疏水基团的外露，使蛋白质亲水、疏水基团增多，乳化能力增强;但过高的功率又会使蛋白的表面疏水性显著降低，乳化性能下降［22－23］。因此，超声波功率的大小对KBP乳化性能改善至关重要。

图5 超声波功率对芸豆蛋白乳化性的影响

2.6 超声波处理对KBP吸油性的影响

蛋白质的非极性区域和脂类的非极性脂肪族链间存在疏水作用，蛋白质与甘油三酸酯形成脂－蛋白复合物，因而具有吸油性。由图6可以看出，在0～200 W范围内，随着超声波功率的增加，KBP的吸油性增加。因为，超声波作用使得蛋白分子原有构象发生变化，结构变的疏松，将原来在分子内部的一些非极性基团暴露在分子表面，改善了蛋白分子的吸油性。但另一方面，超声波功率继续增大时，蛋白质逐渐变性，不溶性蛋白增多，导致功率＞200 W时吸油性逐渐下降。

图6 超声波功率对芸豆蛋白吸油性的影响

3 结论

超声波对蛋白质理化性质及功能性质的影响归根结底是由于超声波对其结构变化产生了作用。通过对不同功率超声波处理KBP后的紫外光谱和荧光光谱分析发现，超声波处理改变了KBP的空间结构。蛋白空间结构的变化引起了功能性质的改变。表现在，KBP的溶解度随着超声波功率的提高而增加，当超声波功率分别为400 W和500 W时，KBP的起泡性能和乳化性能最高，超声波功率为200 W时，KBP的吸油性最高。研究表明，通过选择适宜的超声波功率水平能够改善芸豆蛋白的理化和功能性质。

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