潘向昆 王瑛瑶 魏翠平 栾 霞 刘建学 段章群 侯冰冰

(河南科技大学食品与生物工程学院1，洛阳 471003)

(国家粮食局科学研究院2，北京 100037)

结构脂质(structured lipids，SLs)是天然油脂改性的一类特殊的脂肪。其通过一些条件(通常情况下是脂肪酶)来改变天然脂质中脂肪酸的组成和位置，将某些特殊营养或者生理功能脂肪酸结合到特定位置，最大程度发挥合成脂质中各种脂肪酸的功效，因此结构脂质又名重构脂质［1］。广义上的结构脂质是指经过重构天然脂质中甘三酯脂肪酸所在位置和组成改变，即天然油脂的改性产品，天然油脂的风味和物性改变较少，保持了其在食品应用的原来特性［2］。前人曾根据定位在甘油骨架脂肪酸将结构脂质分为定向结构脂质(SSL)和随机结构脂质(SL)，定向结构脂质主要是指长链脂肪酸位于甘油骨架的Sn－2位，中链或短链脂肪酸位于Sn－1，3位的结构脂质(MLM型结构脂质)［3］。

三酰甘油骨架上的脂肪酸消化吸收代谢有特定的生理特点，机体内的脂肪酶水解Sn－1，3位脂肪酸，以游离脂肪酸的形式被吸收，而Sn－2位脂肪酸则以单甘酯的形式被吸收［4］。以1，3特异性固定化脂肪酶催化中碳链脂肪酸辛酸制备的MLM型结构脂质，具有快速消化吸收代谢等特点，从而为特定人群快速提供能量，而且代谢后在体内蓄积少，中链脂肪酸和相同质量的长链脂肪酸相比产生的能量较少，因此还具有减肥等功效［5］。

采用填充床反应器固定化酶催化制备MLM型结构脂质，具有反应条件温和、副产物少且产物便于回收［6］。固定化酶在结构脂质的制备上不仅具有特异性和专一性，而且增加酶的使用寿命，便于条件的调控。本试验以菜籽油和辛酸为底物，采用响应面试验设计和分析方法对影响固定化脂肪酶在填充床中酶催化制备MLM型结构脂质的因素进行研究，以期得到最佳制备条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菜籽油:市购;辛酸、正己烷、异丙醇、乙酸乙酯及丙酮:均为色谱纯，Sigma－Aldrich公司;固定化脂肪酶:Novozyme公司;其他试剂均为分析纯:北京化工厂。

Waters Acouity型超高效液相色谱仪(配ELSD检测器):美国Waters公司;R－215型旋转蒸发仪:BUCHI公司;2005－02型低速离心机:国华机械有限公司;DK－S24型电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 固定化酶催化制备MLM型结构脂质

将水分质量分数调到预增加值后的酶装入固定床反应器，按一定比例称取底物菜籽油与辛酸混匀置于反应器，将底物泵入固定床反应器，控制反应时间，制备混合产物。

1.2.2 MLM型结构脂质的纯化

酶催化酸解反应是在中碳链脂肪酸过量的条件下进行的，得到的产物体系中存在大量的酸，在酶催化酸解反应过程中除了生成不同类型(诸如MMM、MLM、LLM、LLL)的结构脂质以外，还会产生少量甘一脂、甘二脂等中间副产物。因此需要将产物进行纯化。

称取酶催化酸解产物，按酸解产物/乙醇水溶液1∶3比例加入乙醇水溶液(乙醇水体积比70∶30)，剧烈摇匀15 min，3 500 r/min离心20 min，静置15 min，分离出油相，重复3次，将最终得到的样品溶于适量正己烷中，加入2滴酚酞，用0.5 mol/L的KOH乙醇水溶液(乙醇水体积比30∶70)滴定至乙醇水溶液变红，静置5 min，分离正己烷，加入无水硫酸钠出水后旋蒸得到结构脂质。

1.2.3 超高效液相色谱分析方法

样品制备:称取1.2.2所得结构脂质 100 mg，置于5 mL容量瓶中用丙酮定容。过0.22 μm聚四氟乙烯滤膜后取0.2 μL进UPLC(超高效液相色谱)分析。

1.2.4 超高效液相色谱分析条件［7］

采用 BEH C18 柱(2.1 mm ×100 mm，1.7 μm);流动相:丙酮/乙腈(体积比65∶35);ELSD温度:40℃;氮气压力:2.1 MPa。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 反应时间的影响

图1 反应时间对酶催化酸解制备MLM型结构脂质含量的影响

在酶量为10 g(水分质量分数为0.15%)，底物物质的量比(菜籽油/辛酸)为1∶4，反应温度为60℃条件下，考察反应时间对酶催化酸解反应的影响，结果见图1。从图1可以看出，随反应时间的增加，MLM型结构脂质物质的量分数逐渐升高，反应时间为2 h时，MLM型结构脂质含量基本不变，反应达到平衡。随着延长反应时间，MLM型结构脂质的含量虽然有所增加，但是增幅较缓，考虑到试验成本、时间成本和MLM型结构脂质含量增加量等各因素，选择反应时间为2 h较优。

2.1.2 底物物质的量比的影响

在加酶量为10 g(水分质量分数为0.15%)，反应温度为55℃，反应时间为2 h的条件下，考察底物物质的量比对酶催化酸解反应的影响，结果见图2。从图2可以看出，随着底物物质的量比增大，MLM型结构脂质含量逐渐升高，符合反应方程动力学，反应物的增加会使方程向产物增加的方向进行。随着底物物质的量比继续增大，酶的催化效率会受到影响，一方面底物的增多会导致酶的竞争性抑制，另一方面在本试验中过多的辛酸会导致反应体系酸值较低，会导致酶活的降低甚至失活［8］。综合考虑酶的使用寿命和后续对产物的分离纯化，选择菜籽油辛酸底物物质的量比1∶4。

图2 底物物质的量比对酶催化酸解制备MLM型结构脂质含量的影响

2.1.3 反应温度的影响

在加酶量为10 g(水分质量分数为0.15%)，底物物质的量比为1∶4，反应时间为2 h的条件下，考察反应温度对酶催化酸解反应的影响，结果见图3。从图3可以看出，随着反应温度的升高，MLM型结构脂质的含量也随之增加，在温度为55℃时反应体系中的MLM型结构脂质含量达到平衡，随着温度的继续升高，MLM型结构脂质的含量会有所降低，这也说明温度是影响酰基转移的主要因素［9］。考虑到连续试验遇到的酶活降低等问题，选择在酶的温度耐受性范围内，通过提高反应温度来保证酶的催化酸解效率，选取反应温度55℃。

图3 反应温度对酶催化酸解制备MLM型结构脂质的影响

2.1.4 水分质量分数的影响

在加酶量为10 g，反应温度为55℃，底物物质的量比为1∶4，反应时间为2 h，水分质量分数分别为 0%、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.50%、1%条件下，考察对酶催化酸解反应制备MLM型结构脂质含量的影响，结果见图4。从图4可以看出水分质量分数增加值对MLM型结构脂质的含量影响比较复杂，这是由于酶的催化反应是建立在酶特有的空间构型，水对于酶维持活性构型至关重要，但是过多的含水量一方面使底物与酶的活性位点较难结合，导致反应速率的降低，另一方面会使反应由酯化反应向水解反应转变，导致生成目标产物的减少［10］。

图4 水分质量分数对酶催化酸解制备MLM型结构脂质的影响

2.2 响应面分析法优化MLM型结构脂质制备条件

2.2.1 响应面试验设计及结果

在单因素试验基础上，选取反应时间、底物物质的量比、反应温度、水分质量分数为试验因素，MLM型结构脂质含量为指标。各因素的水平编码见表1。

运用Design－Expert 7.0.0数学软件设计四因素三水平的中心组合试验，分析研究影响填充床固定化酶催化制备MLM型结构脂质含量主要因素，包括29个试验，其中24个位析因试验点，5个中心试验点，见表2。

表1 Central composite因素及水平编码表

表2 Central composite试验设计及MLM型结构脂质含量测量值

2.2.2 模型的建立及显著性分析

根据表2的试验数据，以MLM型结构脂质含量(R1)为响应值，利用 Design－Expert 7.0.0 数学软件对填充床制备MLM型结构脂质进行多元回归拟合，得到二次多项回归方程:

R1=42.10+1.80A+1.30B+3.88C+4.55D+0.84AB+2.21AC － 1.01AD+0.82BC+1.55BD+2.24CD －6.90A2－5.96B2－3.30C2－3.78D2

由表3可知，填充床酶催化制备MLM型结构脂质含量回归模型极显著(P＜0.01)。模型一次项均极显著，显著性顺序是D(水分质量分数)＞C(反应温度)＞A(保留时间)＞B(底物物质的量比);二次项AB，BC交互项为显著，其余均为极显著，表明各试验因素对响应值的影响不是线性关系。预测方程的决定系数R2=0.992 2，模型的偏离系数为5.12%，，说明方程的拟合度和可信度较高，可以较好地代表反应参数和响应值之间的关系，可以用上述回归方程对填充床酶催化制备MLM型结构脂质含量进行分析预测和确定最佳生产工艺条件。

表3 二次多项式回归模型ANOVA分析

2.2.3 各影响因素的交互作用分析

2.2.3.1 反应时间与底物物质的量比的交互影响

图5显示了在反应温度为55℃和水分质量分数为0.10%下，反应时间和底物物质的量比对填充床制备MLM型结构脂质含量的交互影响。在底物物质的量比不变的条件下，随着反应时间的逐渐增加，MLM型结构脂质含量出现先增大后减小的趋势，这是由于随着反应时间的延长，MLM型结构脂质含量增大，达到平衡后，反应时间的增加会使结构脂质出现酰基转移明显增大，导致MLM型结构脂质含量的减少。反应时间不变的条件下，随着底物物质的量比的增大，MLM型结构脂质含量出现先增大后减小现象。

2.2.3.2 反应时间与反应温度的交互影响

图6显示了在底物物质的量比为4∶1和水分质量分数为0.10%下，反应时间和反应温度对填充床制备MLM型结构脂质含量的交互影响。在反应时间不变的条件下，随着反应温度的逐渐增大，MLM型结构脂质含量出现先增大后减小，原因在于反应温度的增大，逐渐接近酶的最适温度使酶活逐渐达到最大，当超过最适温度时酶活受到抑制从而使MLM型结构脂质含量出现下降。在反应温度不变的条件下，随着反应时间的逐渐增加，MLM型结构脂质含量出现先增大后减小的趋势。

2.2.3.3 反应时间与水分质量分数的交互影响

图7显示了在底物物质的量比为4∶1和反应温度为55℃下，反应时间和水分质量分数对填充床制备MLM型结构脂质含量的交互影响。在反应时间不变的条件下，随着水分质量分数的逐渐增大，MLM型结构脂质含量随之增加，达到最大后出现较小幅度的下降，原因在于水分质量分数的增加使酶活性位点充分暴露从而使催化效率增大，当水分质量分数继续增大会使产物发生水解反应。在水分质量分数不变的条件下，随着反应时间的逐渐增加，MLM型结构脂质含量出现先增大后减小的趋势。

2.2.3.4 底物物质的量比与反应温度的交互影响

图8显示了在反应时间2 h和水分质量分数为0.10%下，底物物质的量比和反应温度对填充床制备MLM型结构脂质含量的交互影响。在反应温度不变的条件下，随着底物物质的量比的逐渐增加，MLM型结构脂质含量出现先增大后减小的趋势，原因在于随着底物物质的量比的增大，会使反应向着产物增加的方向进行，但当底物物质的量比达到一定程度时，反应体系的pH很低，一方面导致酶活的降低甚至丧失，另一方面也会使反应产物发生酸解。当底物物质的量比不变的条件下，随着反应温度的增加，MLM型结构脂质含量出现先增大后减小的趋势，但是减少较小。

2.2.3.5 底物物质的量比与水分质量分数的交互影响

图9显示了在反应时间2 h和反应温度为55℃下，底物物质的量比和水分质量分数对填充床制备MLM型结构脂质含量的交互影响。在所选的范围内存在极值，即存在响应面最高点。沿水分含量轴向等高线较沿底物物质的量比轴向等高线密集，说明水分质量分数对MLM型结构脂质含量影响比底物物质的量比显著。

2.2.3.6 反应温度与水分质量分数的交互影响

图10显示了在反应时间2 h和底物物质的量比为4∶1时，反应温度和水分质量分数对填充床制备MLM型结构脂质含量的交互影响。反应温度和水分质量分数对MLM型结构脂质含量影响都较显著，当反应温度较低时，水分质量分数的增加对MLM型结构脂质含量影响较为明显，出现先增大后减小的趋势。当温度达到一定程度时，随着水分质量分数的增加，MLM型结构脂质含量减小的趋势减缓。综合图5～图10可知，4个试验因素对填充床制备MLM型结构脂质含量的影响均不是简单的线性关系，且影响都极显著。水分质量分数是影响填充床制备MLM型结构脂质含量的最主要因素，其次是反应温度，底物物质的量比对其影响最小。

2.2.4 制备MLM型结构脂质最佳条件的确定及验证

通过Design－Expert 7.0.0数学软件得出最佳制备MLM型结构脂质条件:保留时间为2.12 h，底物物质的量比为4.32，反应温度为60.14℃，水分质量分数为0.15%。回归方程预测MLM型结构脂质摩尔分数为46.66%。

在实际的操作过程中，填充床固定化酶制备MLM型结构脂质工艺条件为:保留时间为2 h，底物物质的量比为4.5，反应温度为60℃，水分质量分数为0.15%。得到 MLM型结构脂质摩尔分数为46.12%，与理论预测值基本一致，相对误差为1.16%。说明回归方程与实际情况拟合很好，验证了所建立模型的正确性，该工艺参数具有实用价值。

3 结论

在单因素试验的基础上，通过 Design－Expert 7.0.0数学软件分析保留时间、底物物质的量比、反应温度和水分质量分数等因素对制备MLM型结构脂质的影响，优化确定填充床固定化酶催化制备MLM型结构脂质的最佳工艺条件:保留时间为2 h，底物物质的量比为4.5，反应温度为60℃，水分质量分数为0.15%。在此工艺条件下MLM型结构脂质物质的量分数为46.12%，在最佳工艺条件下重复试验MLM型结构脂质物质的量分数为46.66%，与方程模型预测一致。

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