王 靖，李 俊，吴学东，王 宁

(1大理学院基础医学院，云南大理671000;2大理学院附属医院)

获得性漏斗胸膈肌肌凝蛋白重链MyHC-Ⅰ的表达变化和意义

王 靖1，李 俊2，吴学东2，王 宁2

(1大理学院基础医学院，云南大理671000;2大理学院附属医院)

目的 通过检测获得性漏斗胸大鼠膈肌肌凝蛋白重链MyHC-Ⅰ的表达变化，探讨肌凝蛋白重链在获得性漏斗胸发生发展中的作用。方法 选用4周龄SD大鼠48只，随机分为3组，每组16只。其中肋软骨组和膈肌组分别为从胸骨旁切断下位3对肋软骨并造成膈肌局部物理损伤而获得漏斗胸模型，对照组不做任何干预。于术后第2周和第4周每组各处死大鼠8只，收集膈肌组织，分别进行RT-PCR定量和Western blot检测。结果 肋软骨组和膈肌组动物均呈现前胸壁凹陷畸形。与对照组比较，肋软骨组和膈肌组各时间点MyHC-Ⅰ表达均升高(P＜0．05);但肋软骨组和膈肌组组间比较，仅术后第2周时MyHC-Ⅰ表达差异有统计学意义(P＜0．05)。结论 获得性漏斗胸动物膈肌肌凝蛋白重链MyHC-Ⅰ表达增高，说明在动物漏斗胸畸形形成过程中膈肌功能发生了改变。

获得性漏斗胸;膈肌;肌凝蛋白重链

漏斗胸(PE)是人类最常见的前胸壁凹陷性畸形，呈漏斗状。其发病率为1/300～1/1 000，约占胸壁畸形的87%［1］。近年来，PE的手术治疗效果有了明显提高，但其病因和发病机制的研究一直未取得明显进展。在PE的研究过程中曾提出过多种病因假说［1］，膈肌发育异常就是其中较为重要的一种，但尚未得到充分证实。我们于2010年9月～2011年6月进行本研究，通过不同造模方法获得PE动物模型，并对其膈肌肌凝蛋白重链(MyHC)亚型MyHC-Ⅰ的表达进行分析，旨在探讨膈肌MyHC与获得性PE发生发展的关系。

1 材料与方法

1．1 材料与试剂 SD大鼠购自中山大学实验动物中心，生化试剂购自Amresco公司，TRIzol购自Invitrogen公司，First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司，荧光定量 PCR试剂盒(SYBR Green)购自TaKaRa公司，ECL显色液、MYH7单抗购自Santa Cruz公司。

1．2 获得性PE动物模型的建立 选用同批不同窝4周龄SD大鼠48只，随机分为3组，每组16只，其中第1组从胸骨旁切断下位3对肋软骨(肋软骨组)，第2组经右侧膈肌脏面向肌性部分注射95%乙醇造成局部物理损伤(膈肌组)，第3组对照组不做任何干预。观察并记录动物发育及胸壁外观的变化。然后分别于术后第2周和第4周采用颈椎脱臼法每组各处死8只大鼠，取大鼠完整膈肌，用冰生理盐水冲洗后放入液氮中保存备用。

1．3 RT-PCR检测MyHC-ⅠmRNA水平 切取大鼠膈肌组织，按TRIzol Reagent说明书提取总RNA，经逆转录得到 cDNA。采用染料法(SYBR GreenⅠ)进行相对定量分析，实验在ABI7300荧光定量PCR仪上进行，内参为大鼠GAPDH。定量引物为: MyHC-Ⅰ-F:5'-CAGGCGGAACAAGACAAC-3';My-HC-Ⅰ-R:5'-TCTCGGTCATCTCCTTCAC-3';扩增长度为 100bp。GAPDH-F:5'-AAGTTCAACGGCACAGTCAAG-3';GAPDH-R:5'-CATACTCAGCACCAGCATCAC-3';扩增长度为121 bp。

1．4 Western blot检测MyHC-Ⅰ表达水平 切取大鼠膈肌组织，采用改良的提取方法［2］进行总蛋白提取，用蛋白定量试剂盒检测所得总蛋白浓度后，每孔加样100 μg，进行SDS-PAGE电泳，然后转膜，用封闭液4℃封闭过夜，加入1∶200稀释的一抗4℃孵育12 h，二抗室温孵育2 h，化学发光按操作说明进行。

1．5 统计学方法 基因的相对表达水平用与GAPDH基因的相对水平表示。采用SPSS17．0软件进行单因素ANOVA分析，以P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 PE动物模型观察结果 肋软骨组接受造模手术后动物胸壁的改变与文献报道［2］一致，膈肌组结果也相似，呈明显的前胸壁凹陷畸形，术后4周畸形程度已经基本稳定。因此，2组均成功获得PE畸形动物模型。

2．2 定量检测结果 见表1。

表1 荧光定量检测MyHC-Ⅰ表达水平(n=8，珔x±s)

2．3 Western blot检测结果 实验组中MyHC-Ⅰ表达水平较对照组升高，且组中样品间差异不明显。见图1。

图1 Western blot检测MyHC-Ⅰ于4周时的表达

3 讨论

PE是最常见的前胸壁畸形，常导致患者心肺功能损害和心理障碍［3］，中重度者需手术矫正，尽管经过近100年的临床探索取得了丰硕的临床成果，但其病因和发病机制一直未能取得明显进展，这在很大程度上制约着临床对PE本质的认识和防治措施的研究，也严重制约着临床治疗的进一步深入。

针对PE的研究已提出多种病因假说或学说，膈肌发育异常就是其中之一。1953年Brodkin提出膈肌功能性异常理论，认为部分前方膈肌发生肌肉纤维化，引起吸气时膈肌的异常挛缩而过度牵拉胸壁，从而导致前胸壁的凹陷或凸起畸形。但是Brodkin的假说不能解释所有PE的形成，部分前方膈肌肌肉纤维化可能只是形成 PE的部分原因［1］。Theerthakarai等［4］也认为PE是由于膈肌前半部发育异常，膈肌与胸骨下段之间存在纤维索，纤维索向后牵拉胸骨而形成。但膈肌发育异常理论尚未得到充分证实。

在整个呼吸活动中膈肌是最大的吸气肌，膈肌收缩所产生的通气量占静息通气量的 60% ～80%［5］。如果因某种因素而导致呼吸功能改变，则膈肌将成为最敏感的靶器官之一，继之可能发生形态和功能的变化。PE的研究［1，5］都提示，在胸廓的完整性遭到破坏和胸壁软化基础上，呼吸肌特别是膈肌的收缩和牵拉在其发生中可能发挥着重要的作用。为了维持机体的氧需要，膈肌的负荷增加，直接的表现是膈肌舒缩频率增快、舒缩幅度加大，随之而来的将可能是膈肌代偿性肥厚、功能增强，功能增强后的膈肌对脆弱的前下胸壁的牵拉作用增强，将可能使胸壁在非正常形态下重新塑形。因而研究PE中膈肌的适应性变化将有助于阐明膈肌在PE发生中的作用机制。

膈肌在组织学上属于骨骼肌，而肌纤维是构成骨骼肌的基本单位。肌凝蛋白是肌纤维中最主要的收缩蛋白，由两条肌凝蛋白重链和两对具有ATPase活性的肌凝蛋白轻链组成。肌纤维类型的不同和其收缩特性是由肌凝蛋白重链所决定的［6］，因此膈肌的舒缩功能同样受肌凝蛋白重链的调节，膈肌病理情况下的代偿作用与膈肌中不同表型的肌凝蛋白及其异构体组分改变关系密切［7］。研究表明，骨骼肌MyHC的表达受生长发育中多种因素的影响，且MyHC亚型表达的转变遵循ⅠⅡaⅡxⅡb的专一途径［8］。对骨骼肌的研究发现，膈肌负荷的慢性增加会引起低ATP酶活性的慢型MyHC积聚和高ATP酶活性的快型MyHC减少，且这种转换会随呼吸功能恶化而增加［9］。MyHC的这种转变与降低未负荷肌肉的收缩速度和节约能耗密切相关，是病理情况下的一种有效代偿。因此，研究获得性PE膈肌MyHC-Ⅰ的表达变化将有助于认识PE发生时膈肌功能的改变情况，并对阐明膈肌在PE发生发展中的作用机制有重要意义。

本研究按照吴学东等［5］的方法建立了肋软骨组PE大鼠模型，肋软骨的损伤会造成维持正常胸廓形状的完整肋骨环结构被破坏，致使其抵抗胸内负压和呼吸肌牵拉的作用丧失，而导致胸廓畸形发生。同时，通过注射95%乙醇造成膈肌物理损伤的方式获得了生长发育期大鼠前胸壁凹陷畸形模型。在此基础上，分别于术后不同时间点取动物膈肌组织进行研究。通过荧光定量和Western blot检测发现:第2周和第4周两实验组的MyHC-Ⅰ表达均较正常对照组升高，说明在动物PE畸形形成过程中膈肌慢型肌纤维成分增加，膈肌收缩力减弱。2周时膈肌组的MyHC-Ⅰ表达较肋软骨组更高，4周时无明显差异，这可能是由于膈肌物理损伤造成膈肌瘢痕修复，导致膈肌肌纤维成分改变，进一步影响抗弯曲能力较弱的肋软骨，从而使前胸壁重新塑形，形成前胸壁凹陷畸形，从而使胸腔的整体容积减小，肺的扩张受到抑制，尤其是吸气时肺扩张受限，阻力增加，出现限制性呼吸困难，为保证机体氧气供应量，膈肌的负荷增加，发生疲劳，膈肌肌纤维出现适应性改变，即Ⅰ型(慢型)同源蛋白表达增加，故MyHC-Ⅰ表达并没有因为幼鼠的生长发育而恢复到正常水平，而是作出了适应性的变化。而我们之前的研究结果［10］提示，相同观测时点上模型动物膈肌MyHC-Ⅱa表达下降，同样不随幼鼠的生长发育而恢复到正常水平。

综上所述，当动物发生前胸壁凹陷畸形时，膈肌负荷增加而发生膈肌疲劳，膈肌肌纤维出现适应性改变，表现为MyHC-Ⅰ表达升高而MyHC-Ⅱa表达下降，慢型肌纤维成分增加而快型肌纤维减少，膈肌收缩力减弱而变得缓慢持久。膈肌肌凝蛋白重链组分异构体在漏斗胸发生发展中的这一转变模式进一步证实呼吸道、肺和膈肌结构改变导致的一系列功能异常都有可能是PE形成的原因。具体机制尚需基础与临床的进一步研究和探索。

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R655

A

1002-266X(2012)44-0046-03

2011-11-12)

云南省教育厅科研基金重点项目(08Z0071);大理学院青年教师科研基金一般项目(KYQN2009-43)。

李俊，E-mail:lijun8720@163．com