赖前成，邓永花，万居易，伍长学，王 波，廖 斌

(1泸州医学院附属医院，四川泸州646000;2成都市第二人民医院)

急性肾功能衰竭(AKI)是心脏手术后最常见的并发症之一，体外循环是目前心脏外科心内直视手术不可避免的复杂的病理生理过程，复杂的管道系统、体外循环转机时间、灌注流量和压力、灌流模式等多种因素可导致患者术后发生肾功能损伤［1］。动物实验或者已有的缺氧复氧细胞培养模型均无法真实模拟这种复杂的环境。为此，本研究2009年12月～2010年12月通过改良细胞培养模型，采用体外循环再灌注血进行人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)缺血再灌注损伤研究，并初步分析可能的分子机理，为进一步研究防治体外循环后肾小管细胞损伤奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人HK-2引自ATCC(American Type Culture Collection);DMEM(GIBCO);胰酶(OXODI);胎牛血清(成都哈里公司);Annexin VFITC细胞凋亡检测试剂盒(北京中杉金桥公司); SP-9000免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥公司);多聚赖氨酸，DAB显色试剂盒(武汉博士德公司);其余试剂均为市售分析纯。实验在我院中心实验室实施。

1.2 方法

1.2.1 HK-2细胞株的复苏、培养、传代 从液氮罐中取出冻存的HK-2细胞投入37℃的温水中，摇动使其尽快解冻。吸出细胞悬液并滴加10倍体积的质量分数为10%的胎牛血清的DMEM培养基，混匀，1 000 r/min离心5 min，弃上清液后再重复洗涤1次。用含10%的胎牛血清的DMEM培养液将细胞悬液稀释混匀，接种于100 mL培养瓶中，37℃下5%CO2细胞培养箱中静置12 h，换液除去未贴壁细胞后至细胞长满成片 80%以上。用浓度为0.25%的胰蛋白酶消化，传代。

1.2.2 正常人体外循环再灌注血清的制备 ①随机采集5例健康志愿者外周血约5 mL，立即在4℃离心机1 500 r/min离心15 min，收集上清，－20℃保存备用。②随机选取我科5例体外循环手术主动脉阻断时间在60 min以上患者，于开放主动脉1 h后采集患者外周血，立即在4℃离心机1 500 r/min离心15 min，收集上清，－20℃保存备用。

1.2.3 肾小管上皮细胞缺血再灌注模型的建立①培养肾小管上皮细胞的缺血模拟:100%N2饱和无糖无机盐缓冲液40 min，吸弃6孔板及培养瓶内的细胞培养基，用无糖无机盐缓冲液冲洗，加入100%N2饱和无糖无机盐缓冲液，置95%N2+5% CO2环境培养2 h。②培养肾小管上皮细胞的再灌注模拟及分组:吸弃6孔板及培养瓶内无糖无机盐缓冲液后，实验组加入含10%体外循环再灌注血清的DMEM低糖培养基，置95%O2+5%CO2环境培养4 h。对照组以正常人血清代替再灌注血清，空白组不含血清。处理后的6孔板内的肾小管上皮细胞用于免疫细胞化学法(ICC)检测。培养瓶内的肾小管上皮细胞消化离心洗涤后用于流式细胞仪测定细胞凋亡。

1.2.4 细胞凋亡检测分析 Anexin V/PI染色:胰酶消化细胞，PBS清洗2次，加入适量的荧光标记的Annexin V试剂和PI，混匀后避光室温下孵育15 min，孵育后加入400 μL染色缓冲液，立即上流式细胞仪分析并记录结果。

1.2.5 Caspase-3蛋白表达检测 按试剂盒说明书操作，采用过氧化物酶标记的链霉卵白(Streptavidin/Peroxidase，SP)染色的免疫组化检测Caspase-3蛋白表达。

1.2.6 图像分析及统计学方法 图像分析采用Image-Pro Plus6.0图像分析系统统计积分光密度(IOD)值。实验数据均以±s表示，显著性检验应用单因素方差分析在SPSS13.0统计软件包完成。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞凋亡检测 流式细胞仪检测结果显示，体外循环血清处理后，肾小管上皮细胞出现了凋亡，实验组凋亡率(38.96% ±9.70%)高于对照组(29.83%±8.76%)和空白组(28.76%±7.38%)，P＜0.05。对照组与空白组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 Caspase-3免疫组化检测 实验组Caspase-3蛋白的IOD值(99.87±20.38)高于对照组(63.57 ±19.83)及空白组(60.58±15.74)，P＜0.05;对照组与空白组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见插页Ⅰ图9。

3 讨论

体外循环心脏手术后AKI的发生率为20%～30%，其肾损害轻重不一［2］。动物实验证实体外循环并发AKI主要原因是肾小管损伤［3］，其致病因素较复杂，包括缺血再灌注损伤及全身炎症介质，常常是综合性因素所致［4］。Turkmen等［5］通过动物实验缺血再灌注损伤模拟体外循环对肾小管细胞损伤作用，观察到肾小管细胞的坏死、凋亡等变化。也有通过肾小管细胞缺氧复氧培养来研究肾小管细胞的损伤作用［6］。然而，体外循环不仅仅是肾脏在体外循环时受到缺血再灌注损伤，还包括全身多个器官，多种炎症介质在开放升主动脉后参与对肾小管细胞的损伤作用［4］，但目前全面真实的模拟体外循环手术后对人近端肾小管上皮细胞损伤的研究还较少。为此本实验采用心脏体外循环手术后血清为研究对象，能较全面真实模拟上述因素对人肾小管的损伤作用。

已有实验证据支持凋亡在AKI中的致病作用，而且认为HK-2细胞对凋亡高度敏感，对整个器官衰竭具有重要作用［7］。本实验通过AnnexinV-FTTC/PI标记流式细胞分析法分析了各组肾小管细胞凋亡早期细胞膜的重排，从而可敏感发现体外循环后对肾小管细胞的早期损害。实验组较对照组、空白组凋亡率明显增高，说明体外循环血清对人肾小管上皮有致凋亡作用。随着对在AKI中肾细胞死亡机制的认识，将产生新的治疗靶点［7］。

Caspase-3是凋亡执行的重要效应分子，是凋亡发生的关键效应酶。其表达的增加、激活是凋亡信号转导路径中的关键环节，是凋亡启动过程中的早期事件，是参与调节和执行细胞凋亡最重要的蛋白酶之一［8］。细胞凋亡的主要细胞信号通路有Caspase依赖的通路和非 Caspase依赖的通路［9］。本研究实验组较对照组及空白组Caspase-3蛋白表达明显增高，这可能激活了依赖Caspase凋亡信号通路，致人肾小管上皮细胞凋亡。

本实验较真实的模拟了体外循环后各种致病因素，采用人肾小管细胞作为研究对象，直接观察到体外循环术后对人肾小管细胞的损伤作用。从而在细胞水平为研究保护术后肾脏损害提供了一种较真实可信的方法。

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［6］Xiang HL，Xue WJ，Hou J，et al.Protection of human renal tubular epithelial cells(HK-2 cells)from hypoxia-reoxygenation damage by recombinant adenovirus containing hCGPx gene［J］.Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2006，22(4):472-474.

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［8］吴广礼，黄旭东，张丽霞.过度训练可通过破坏Bax/Bcl-2平衡激活caspase依赖的凋亡通路诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡［J］.中华肾脏病杂志，2011，27(2):118-123.

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