王 凤，汤德元*，罗险峰，曾智勇，马 萍，李春燕

（1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008）

猪水疱疹病（VES）是由猪水疱疹病毒（SESV）引起的猪的一种高度传染性的急性疾病，其特征是在唇、齿龈、舌、腭、鼻镜及四肢的蹄踵和趾间发生水疱性炎症，临床上很难与猪口蹄疫、猪水疱病和猪水疱性口炎相区别。本病最早(1932年)发现于美国加利福尼亚州，此后每年都有发生。1953年后蔓延至美国其他各州，42个以上的州经常发生。随后由于立法禁止以未煮熟的泔水喂猪，并对发病猪场采取屠杀对策，疫情明显下降。最后一次暴发于1956年，美国官方于1959年宣布在全国范围内消灭了本病。1973年由海狮中分离到一株杯状病毒，其特性与水疱疹病毒相同，称为圣米吉尔海狮病毒(SMSV)，将该病毒接种给猪，可引起典型的水疱疹病变。人们认为，SMSV和SESV实际上是同一种病毒。至少从5种水生动物和2种陆生动物体内检出了SMSV抗体，说明SESV虽已从家养猪群中清除，但野生的陆生或水生动物中仍然可能存在。目前为止我国还未发现该病的流行，但随着我国与其他各国贸易往来的加大，以及我国广阔的海洋动物资源的开发利用，该病的潜在威胁应引起足够的重视，因此，本文综述了猪水疱疹病诊断技术的研究进展，以期为猪水疱疹病的预防奠定基础。

近年来，随着生物技术的迅速发展和仪器设备的不断更新换代，VES的检测技术也得到了空前的发展。已经建立了许多检测方法，现将猪水疱疹病诊断技术的研究进展综述如下：

1 猪水疱疹病的临床诊断

猪感染本病毒12～48 h后，体温升高(39.5～40.5 ℃)，持续高热24～72 h，病猪精神不振，食欲下降，不爱活动，数天后在鼻镜、唇、齿龈、舌、口腔、乳房、背部、腹部、蹄冠、蹄踵和趾间等部位出现红点状成硬块的小水疱，初期水疱外观苍白、隆起，直径5～30 mm，隆起高度约l0～20 mm。这种水疱类似烧烫伤或真皮过度摩擦所形成的水疱，泡内充满透明或灰白色浆液性液体，内含有大量病毒，有的水疱可融合，2 d后水疱破溃，皮肤糜烂、溃疡，形成褐色干痂。硬块部位皮肤变薄，一搓即破，露出鲜红嫩肉(组织)。随后体温下降，初期水疱破裂，暴露出夹杂有鲜红、苍白和黄色纤维性渗出或坏死的真皮糜烂面，渐渐干涸形成褐色干痂，通常 5～7 d内愈合，干痂脱落，遗留轻微的疤痕，同时体温恢复正常，疼痛、肿胀随之减轻，动物趋于恢复。单纯感染本病时，病猪可以迅速康复，无其他后遗症。若有化脓性继发感染时，病期可长达1～3个月， 严重时可造成病猪蹄壳脱落，且带有跛行症状，不能行走，起立困难，驱赶时嚎叫。新旧蹄壳替换后，可出现一条暗棕色或黑色的替换线，据此，可做出SVEV感染的初诊。该病病程较短，一般病程为l周左右，口部病变愈合较快，但蹄部受环境影响可能继发细菌感染而引起持续几周的跛行。如果整个猪群都受到感染，有时可持续几星期到几个月。成年猪死亡率很低，但哺乳仔猪死亡率升高。据报道，乳猪的死亡是由于鼻孔中形成的水疱窒息所致，或者由于母猪不泌乳而饿死或并发严重的腹泻。

2 猪水疱疹病的病理解剖诊断

发病初期，病猪皮肤和黏膜出现小面积变白并且隆起的水疱，随着水疱的形成而扩散增大，水疱破裂部位发红、溃疡、糜烂。高出皮肤的水疱，充满透明液体，皮下组织充血、水肿，有时出血。在四肢的蹄部趾间和蹄冠及在嘴筒的鼻镜处出现黄豆般大的小瘤,其内充满一些较澄清的液体,水疱破裂后患处即呈轻度溃疡。扁桃腺是最易受SVEV侵袭的器官，解剖可见扁桃腺呈暗红色肿胀。同时可见胸腹部皮肤发绀，胸腹腔和心包积液，并含有少量纤维蛋白。心脏软而苍白，心肌可见明显心肌炎，心肌充血、水肿，心肌纤维变性、坏死以及淋巴细胞和巨噬细胞浸润，灶性病变可见白垩中心，在右心室外膜最为多见，伸长到心肌的不同深度。坏死心肌有无机盐沉着，形成钙化。心膜层的渗出液中有嗜酸性细胞浸润。肝脏和肺脏充血，轻度肿胀。脾褪色，轻度脑炎，可见点状神经元变性区，脑膜轻度充血。局部淋巴结充血、水肿，大量淋巴细胞变性、坏死。水疱液、水疱皮和淋巴结中含有大量的病毒，有时血液中也可检测到少量病毒。

3 猪水疱疹病的的实验室诊断

通过常规诊断方法可初步诊断本病，但要确诊本病主要依靠实验室诊断。常用的实验室诊断方法有：病原学诊断、中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、补体结合试验、免疫荧光试验等。

3.1 猪水疱疹病的病原学诊断

3.1.1 病料采集

水疱液、未破裂的水疱上皮或破裂的新鲜上皮是理想的病毒分离材料。无菌采取患猪水疱液或刚破溃的水疱皮，将水疱皮研磨，加入抗生素液，用PBS作5～10倍稀释，4 ℃浸泡过夜，或置室温4 h，离心除沉淀物，上清即为待检病毒液。

3.1.2 病毒分离

取0.5 mL处理好的病毒悬液上清接种于猪源细胞或Vero猴肾细胞系单层细胞，置37 ℃、5%CO2培养箱，每间隔20 min轻轻振摇1 次，接种1 h后轻轻吸去接种液体后，加入5 mL细胞维持液，继续培养并逐日观察是否出现细胞病变，SVEV导致的典型细胞病变（CPE）表现为细胞圆缩、溶解和细胞单层完全破坏。若5～7 d未出现细胞病变，盲传至少3代方可判为阴性[1]。

3.1.3 电镜观察

一般来说，电镜法可以有效地做出病原的诊断，可以通过电镜来观察病毒的结构、形态特征及立体构型等特点。如将感染猪口腔黏膜细胞培养物制成超薄切片在电镜下观察，则可从平面上观察到病毒的内部结构，形态大小，复制方式等。采集病变部位材料做电镜检查，对区别猪水疱疹病与其他病毒引起的疾病是可行的。用采集的病料或培养物按常规方法初提纯，在电镜下观察到嵌杯样病毒典型粒子形态，作为病原学诊断的参考。

该法最为准确、可靠，但由于费时费力，需要昂贵的电镜设备，限制其广泛使用。

3.2 猪水疱疹病的血清学诊断

3.2.1 病毒中和试验

病毒中和试验(VNT) 只适用于检查已知特异性病毒抗原或抗体，因为杯状样病毒型多，型间又很少有交叉反应，因此中和试验应用较少。VNT在平底微量组织培养板中进行，用灭活血清样品、l 000TCID50(半数组织培养感染量)的新泽西型(NJ)或印第安型(IN)VES病毒和预先制备Vero单层细胞悬液检测未中和的病毒。试验程序：

1）病毒：NJ或IN型VES病毒于Vero单层细胞单层上生长，并于液氮或-70 ℃保存。

2）被检样品：在试验前，血清于56 ℃灭活30 min，阳性和阴性标准对照血清用同样的方法处理。

3）病毒中和：从l∶4开始，将血清在平板上以2倍横向连续稀释，每份血清用2排孔，每孔加入相同体积的大约含l 000TCID5025μL的NJ或IN型VES病毒悬液，37 ℃孵育60 min进行中和，随后，向长成单层的微量培养板上每孔加进50μL混合物，或将含有血清／病毒混合物和l50 μL Vero细胞悬液同时加到各孔内，用合适的盖子盖紧，于5%CO2下37 ℃培养48～72 h，或用胶带封板在普通条件下培养(实验已证明1000TCID50的病毒滴度可以减少非特异性反应而维持较高的试验敏感性)。

4）结果判定：没有出现CPE的孔认为是被保护。当l 000TCID50的值在750～1330TCID50之间，而阳性和阴性标准血清的滴度在其平均值的2倍之内时，用Spearmann-Karber方法计算终点滴度。每份血清100%的中和滴度以logl0表示。血清滴度值等于或大于1/32时，即判为VES阳性。

3.2.2 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(ELISA)具有快速、可靠、灵敏度高的优点，不受补体和抗补体因子的影响而广泛使用[2]。液相阻断ELISA(LP-ELISA)是VES病毒抗体检测和定量的首选方法。建议以病毒糖蛋白作为抗原，因其无感染性，检测中和抗体、假阳性比VN试验要低。试验程序：

1）包被：用pH9.6的碳酸盐／碳酸氢盐缓冲液将兔抗血清或正常兔血清作适当稀释[3-4]后包被ELISA板，37 ℃孵育l h或4 ℃过夜。之后，用磷酸盐缓冲液水(PBS)洗板1次和l%的卵白蛋白(用PBS稀释)室温下封闭1 h。该板可直接使用或洗3次以后保存在-20 ℃备用。

2）液相：从l∶4开始，将每份待检血清在U型微量滴定板中2倍连续稀释，每个稀释度作双份，将等体积的VES病毒NJ或IN糖蛋白稀释液加到每个孔中，37 ℃孵育1 h，然后将50μL混合物转移到包被的ELISA板中，置旋转振荡器上37 ℃反应30 min。

3）特异性抗体：用含0.05%吐温-20、1%卵白蛋白、2%正常兔血清及2%正常牛血清(PBSTB)将抗VES病毒NJ和IN血清型的单价或多价豚鼠抗血清作适当稀释，分别加到相应的包被兔血清孔内，置旋转振荡器上37 ℃反应30 min。

4）酶结合物：将过氧化物酶／兔或山羊抗豚鼠IgG结合物用PBSTB作适当稀释后加入各孔，置旋转振荡器上37 ℃反应30 min。

5）底物：每孔加H2O2活化的底物，在室温下反应l5 min，随后加入硫酸终止反应，用酶标仪测光吸收值。整个试验均使用50μL试剂，每步之间反应板均用含0.05%吐温20的PBS洗5次。所使用的试剂均做对照。

6）结果判定：按照Spearmann-Karber方法，以阴性血清对照降到50%时的log10表示50%终点滴度，滴度等于或大于1／20时判为阳性。

3.2.3 补体结合试验

ELISA比补体结合试验(CF)敏感，不受前补体和抗补体因子的影响。当没有ELISA试剂时，可用CF试验进行诊断。试验程序：

1）抗血清：将豚鼠VES病毒抗NJ型的单价抗血清和豚鼠抗IN型VES病毒的多价抗血清，用巴比妥缓冲液(VB)稀释成含2.5 CFU50(50%补体结合单位)的稀释物，同相应的病毒作用后，并将其加到微量板相应孔内。这些抗血清为ELISA中使用的特异性抗体血清。

2）待检样品：将待测样品的抗原悬液加入血清孔中，抗原悬液的制备同IS-ELISA。

3）补体：将4 CHU50(50%补体溶血单位)加到上述含血清和抗原的各孔内(试验中也可选用7.5、10及20 CHU50)。抗血清、待检样品和补体的混合物于37 ℃孵育30 min。

4）溶血系统：用10 HU50(50%溶血单位)兔抗绵羊红细胞(SRBC)血清致敏SRBC的VB悬液，加到各孔中，溶血系统(即2个体积的溶血系加3个体积的蒸馏水)在545 nm波长下吸收值为0.66。混合物于37 ℃孵育30 min，随后，离心微量板，并用肉眼观察反应。要求抗血清、被检样品和补体的量是25μL，而溶血系统的量是50μL。同时要做与抗血清、抗原、补体和溶血系统相应的对照。可以用比微量板大8倍量的试剂在试管中作CF 50%试验。这时，可用分光光度计在545 nm波长条件下读取光吸收值表示试验结果。

5）结果解释：当各种对照符合要求，而一个型的抗血清在与其他型抗血清以及对照相比其样品溶血小于20%时，则认为其相应的血清型是阳性。将CF试验为阴性的野外样品接种于细胞培养物或断乳的小鼠，如果连传3代均为阴性，该样品被认为是VES病毒阴性。

3.2.4 免疫荧光试验

将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便，特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低，而且每检查一种抗原都就需要制备一种荧光抗体，此法常用于病毒等微生物的快速检查。试验程序：

1）将澄清组织悬液或水疱液接种于Leighton培养管及其25 cm2细胞瓶的培养细胞上。

2）37 ℃孵育1 h。

3）弃去接种物，用细胞培养液洗涤细胞3次，然后用含有2.5%胎牛血清(FBS)的细胞培养液继续培养。

4）将接种的Leighton管细胞培养物置于33～35 ℃并观察CPE。

5）接种后18～24 h，从接种每一样品的Leighton管中取出培养的盖片，用新泽西型(NJ)和印第安型(IN)VESV特异性荧光抗体(FA)结合物染色。

6）将其余的接种的Leighton管和25 cm2细胞瓶在35～37 ℃培养6 d以上，并每天观察CPE。

7）接种后第7天，用FA结合物将Leighton管中剩余的培养盖片染色。如果未观察到荧光而且细胞瓶也无观察到CPE，即可报告样品为VES病毒分离阴性。

8）如果观察到CPE，而FA染色阴性，则按照如上程序，用25 cm2细胞瓶中的细胞进行传代培养。

3.3 猪水疱疹病的分子生物学诊断

VES的诊断技术正在不断地改进和创新，已从病原学与血清学诊断技术扩展到了分子生物学诊断技术的领域。这些新技术的最大优点体现在简便、快速、精确、灵敏，以及检样处理的高通量化。

3.3.1 RT-PCR

近几年发展起来的RT-PCR 技术，具有简单、易操作、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点，已成为病原体检测的重要方法。赵启祖等[5]首次应用 RT-PCR 方法，以SVEV VP3 区编码 VPg和蛋白酶基因序列合成的引物，检测了2株 SVEV 感染 IBRS-2 细胞中的病毒 RNA，在同一RT-PCR 缓冲体系中成功地扩增出了目的基因片段，用 RT-PCR 检测 TCID50为 1.0×10-8.5和乳鼠 LD50为1.0×10-9.0的病毒细胞培养物时，其灵敏度可达 1.0×10-11以上，而正常IBRS-2细胞和 SVEV 感染的IBRS-2 细胞均未扩增出 DNA 片段。

表1 口蹄疫、猪水疱病、水疱性口炎及猪水疱疹病的鉴别[7]

3.3.2 PCR-ELISA

PCR-ELISA 相对于凝胶光密度定量，无论在灵敏度、特异性、精确度上都得到很大的提高，能满足临床诊断的要求。Callens等[6]根据 RTPCR 和 ELISA 的原理，用地高辛标记的 dUTP 标记 212 bp 的扩增子，通过 RT-PCR-ELISA，无需使用巢式聚合酶链式反应即可对猪水疱病进行高效、特异地检测。

4 猪水疱疹病的鉴别诊断

根据病猪突然高热稽留，后唇、齿龈、舌、腭、鼻镜以及四肢的蹄冠、蹄踵和趾间形成水疱，跛行，厌食等临床症状和病理变化，可初步诊断本病。但由于本病临床表现与口蹄疫、水疱性口炎及猪水疱病极为相似。因此，诊断本病必须与口蹄疫、水疱性口炎及猪水疱病进行鉴别。猪口蹄疫、猪水疱病、水疱性口炎和猪水疱疹病的鉴别诊断见表1。

由于控制猪水疱疹病的关键之一在于早期诊断，因此，探索一种高效、快速、敏感的检测方法是今后发展的方向。目前，应用于实验室诊断的方面如RT-PCR法等已能够较敏感的诊断出SESV。有的诊断方法还在研究中，有待进一步完善。随着VES的研究不断深入，分子生物学技术的不断发展，一定会有更灵敏，更准确，操作更简便的VES诊断技术不断出现和应用。

[1] 世界动物卫生组织.哺乳动物,禽,蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册[M].农业部畜牧兽医局，译.第4版.北京:中国农业科技出版社，2002.

[2] Kweon C H, Kwon B J, Kim I J,et al. Development of monoclonal antibody-linked ELISA for serodiagnosis of vesicular stomatitis virus(VSV-IN) using baculovirus expressed glycoprotein[J]. J Virol Methods,2005, 130(1-2):7-14.

[3] Harrsion Stephen C.Viral membrane fusion[J]．Nature Structural Molecular Biology, 2008, 15(7):690-698.

[4] Detje C N, Meyer T, Schmidt,et a1.Local type I IFN receptor signaling protects against virus spread within the central nervous system[J].Joumal nmunolo gy,2009,182(4):2297-2304.

[5] 赵启祖，薛景山，谢庆阁，等．聚合酶链反应（PCR）检测猪水疱疹病病毒的研究 [C]//青岛：第3届全国病毒学学术会议论文集，1994.

[6] Callens M，Clercq K．Highly sensitive detection of swine vesicular disease virus based on a single tube RT-PCR system and DIG-ELISA detection[J]．Journal of virological methods，1999（77）：87-99.

[7] 蔡宝祥.家畜传染病学[M].第4版.北京：中国农业出版社，2001.