HPLC法测定新益肾蠲痹丸中延胡索乙素含量

2012-07-05王伟

淮阴工学院学报 2012年1期

王伟

(江苏正大清江制药有限公司，江苏淮安 223005)

0 引言

新益肾蠲痹丸(浓缩丸)是在益肾蠲痹丸的基础上研制的新药，益肾蠲痹丸收载于《新药转正标准》01册39页，标准号为 WS－68(Z－10)－92(Z)，由生地黄、熟地黄、淫羊藿、骨碎补、延胡索、土鳖虫等十九味药组成，温补肾阳，益肾壮督，搜风剔邪，蠲痹通络，用于风湿及类风湿性关节炎的治疗。延胡索为本方中起止痛作用的主要成分之一，综述了延胡索乙素的常用测定方法，包括薄层色谱法，RP－HPLC，HPLC法等。本研究建立了HPLC法测定新益肾蠲痹丸(浓缩丸)中延胡索乙素的含量，准确性高，重复性好。原标准中采用薄层扫描法测定延胡索乙素的含量，方法操作繁琐，含量重现性差。

1 仪器与试药

惠普HP1100高效液相色谱仪。

延胡索乙素对照品购自中国药品生物制品检定所(批号:0726－200208供含量测定用);新益肾蠲痹丸(浓缩丸)为江苏正大清江制药有限公司自制，批号为:05112301、05112502、05112703、06121101。

甲醇、乙腈均为色谱纯;石油醚(60～90℃)、氨水、醋酸铵、冰醋酸均为分析纯;水为自制纯化水。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

对照品溶液的制备:精密称取延胡索乙素对照品6.48mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(0.2592mg/ml)。精密吸取对照品贮备液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液(25.92μg/ml)。

供试品溶液的制备:取本品研细，取约4g，精密称定，置平底烧瓶中，加入浓氨试液5ml浸润，加石油醚(60～90℃)在水浴上加热回流提取3次，每次加入石油醚(60～90℃)50ml，回流 30分钟，取下，放冷，滤过，用石油醚(60～90℃)10ml分两次洗涤残渣，洗液并入滤液中，减压浓缩至干，用甲醇溶解残渣，定量转移至10ml量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

阴性供试品溶液的制备:按本品处方及工艺制备延胡索缺味样品，照供试品溶液的制备方法处理，作为阴性供试品溶液。

2.2 提取溶剂的考察

称取本品，置平底烧瓶中，分别加入不同的溶剂各50ml，水浴上加热回流30min，滤过，蒸干，照下表中所列方法进行操作、测定，结果见表1。

表1 提取溶剂考察结果

上述试验结果表明，用80%乙醇回流提取后，再用乙醚萃取与氨水－石油醚直接提取的含量结果无明显差异，但乙醚萃取的操作复杂，且杂质多，影响结果的准确性。因此，采用氨水－石油醚直接提取的方法。加热回流时间对含量结果有影响，随着加热时间的延长而含量降低，最终采用提取3次，每次回流时间为30分钟。

2.3 色谱条件

色谱柱为Kromasil(4.6×250mm不锈钢柱，5μm)，流动相为甲醇－乙腈－1%醋酸铵缓冲液(pH=5.0±0.02)(10∶30∶60)，流速:1.0ml/min，柱温 30℃，检测波长 283nm，进样量15μl。

上述色谱条件下，色谱图见图1～图3。

图1 阴性对照溶液

图2 对照品溶液

图3 供试品溶液

2.4 线性范围的考察

分别精密量取延胡索乙素对照品贮备液(0.2592mg/ml)0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。分别进样15μl，记录色谱图，读取峰面积，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标作图，得标准曲线，进样量在0.07776～1.5552ug之间时，进样量与峰面积呈良好的线性关系。标准曲线的回归方程Y=893.02Χ－4.5035，相关系数 r=0.9999。