张兴儒 俞彰 盛霞 徐建江 张振永 周欢明 刘斌 朱文卿 李轶捷 项敏泓 李青松

1 资料与方法

1.1 临床资料 患者男性，76岁。双眼干涩、异物感、溢泪3年，2010年7月8日来我科就诊。患者2年间曾就诊多家医院，给予抗生素滴眼液、人工泪液等药物治疗未见好转。否认糖尿病、肾病、甲状腺、眼部外伤等病史。眼部检查:右眼视力0.8，松弛球结膜堆积在眼球与下睑缘之间，皱褶明显，超过泪河高度，结膜松弛症分级［1］为Ⅱ级(图1)，测泪膜破裂时间(break-up time，BUT)3 次平均为 7.33 s，基础泪液分泌试验(SchirmerⅠ test，SⅠt)为9mm;冲洗泪道通畅。2010年10月20日患者右眼在5 g/L爱尔卡因结膜囊表面麻醉下，行新月形切除手术［2］。手术后8周，症状消失，松弛结膜消除，泪河恢复(图2)。BUT为9 s，SⅠt为9mm。球结膜手术切口对位愈合好，眼球运动正常。

图1.右眼松弛球结膜堆积在眼球与下睑缘之间，皱褶明显，超过泪河高度

图2.右眼结膜松弛症新月形切除手术后8周，症状消失，松弛结膜消除，泪河恢复

1.2 术中组织形态观察 采用结膜松弛症新月形切除术［2］，开睑后，球结膜松弛成皱褶不规则堆积。结膜囊冲洗，球结膜松弛皱褶随水流移位幅度大。球结膜下注射2%利多卡因，药液快速弥散在结膜下间隙中，看不到局限性隆起。在角膜缘外5mm切开球结膜，球结膜变薄，筋膜萎缩。球结膜切开后直接看到巩膜表面，球结膜与筋膜与巩膜黏合力明显下降，球结膜容易移位。缝合切口时球结膜弹性差，容易撕裂。手术切口愈合缓慢。

1.3 相干光断层扫描 结膜松弛症手术前右眼在顺时针7:30方位，距角膜缘5mm外，采用相干光断层扫描(optical coherence tomography，OCT)(CirrusTMHD-OCT 4000 ，Carl Zeiss Meditec Inc)球结膜和筋膜图像分析并进行厚度测量［3］，球结膜上皮层面凹凸不平，上皮细胞层与结膜固有层结合疏松，固有层和筋膜变薄，球结膜厚度为136μm(图3);而对照组(年龄配对眼表正常者)球结膜上皮层形态、结构完整，表面光滑平整，上皮层与固有层结合紧密，固有层与巩膜的结合密切，球结膜厚度为236μm(图4)。

图3.结膜松弛症手术前OCT 4000下可见球结膜上皮层高低不平，上皮细胞层与结膜固有层结合疏松，固有层和筋膜变薄，球结膜厚度136μm

图4.对照组(年龄配对眼表正常者)上皮细胞层细胞排列均匀，与基质边界清楚，上皮细胞层厚度为48μm;球结膜固有层组织均匀，与筋膜结合紧密，边界清楚，球结膜厚度为236μm

1.4 共聚焦显微镜检查 右眼结膜松弛症手术前在顺时针7:30方位，距角膜缘5mm外，采用Heidelberg公司生产的HRT共聚焦显微镜对球结膜各层活体观察。结膜松弛症上皮细胞层内有较多的朗格汉斯细胞球(图5)，结膜松弛症球结膜固有层纤维稀疏不规则(图6)。

图5.共聚焦显微镜下结膜松弛症上皮细胞层内有较多的朗格汉斯细胞球(×800，HRT系列)

图6.共聚焦显微镜下结膜松弛症球结膜固有层纤维稀疏不规则(×800，HRT系列)

1.5 组织病理学观察 手术切除病变组松弛结膜和对照组的对应区结膜。立即用10%甲醛液固定，常规脱水，石蜡包埋，做5μm 切片，用苏木精-伊红(hematoxylin eosin，HE)染色、Verhoeff弹力纤维染色、Masson三色染色和Mallory磷钨苏木素染色。结膜松弛症的结膜病理表现为结膜弯曲皱褶，厚薄不均，角化不全;上皮下组织减少、疏松，筋膜萎缩，结膜与筋膜与巩膜结合疏松;固有层弹力纤维染色示弹力纤维明显减少，几乎消失(图7)。对照组为随机年龄配对的单纯白内障手术患者，结膜表现为结膜上皮层有较多的杯状细胞，固有层与上皮层结合紧密，固有层组织均匀(图8)。

1.6 透射电镜观察 手术切除松弛结膜和对照组切除的对应区球结膜，用2.5%戊二醛液(0.1 mol/L磷酸缓冲液配制，pH=7.2)保存固定后，样本切成＜1mm 3小块，1%四氧化锇(osmium tetroxide，OsO4)(0.1 mol/L 磷酸缓冲液配制，pH=7.2)后固定2 h。梯度乙醇脱水，618#环氧树脂包埋。超薄切片经铀-铅染色后在JEM-1200EX透射电镜下观察。

结膜上皮层超微结构:球结膜上皮细胞表层呈扁平状，中间为多边形，基底层细胞立方形。上皮细胞含有丰富的细胞器，如线粒体、高尔基复合体、粗面内质网，色素颗粒和吞噬体亦可见到。细胞间有桥粒连接，相邻胞质内有张力丝。结膜松弛症组与对照组上皮细胞超微结构无明显差异。

图7.结膜上皮细胞鳞状化增生，上皮下组织减少、疏松，筋膜萎缩，结膜与筋膜与巩膜结合疏松(HE×100)

图8.对照组结膜上皮层有较多的杯状细胞，固有层与上皮层结合紧密，固有层组织均匀(HE×100)

固有层超微结构:结膜松弛症病例显示胶原原纤维稀疏、松散，局部点状变性(图9);成纤维细胞坏死，周边胶原原纤维断裂、扭曲，排列稀疏、松散，部分缺失(图10)。对照组显示周围胶原原纤维整齐排列、紧密，无扭曲、变性、坏死(图11);成纤维细胞核卵圆，胞质细胞器丰富，线粒体数量不多，细胞周边有长胞突，核内染色质均匀分布，在核膜下异染色质较密集。可见到线粒体、溶酶体、脂滴及细丝状细胞骨架成分(图12)。

图9.结膜松弛症病例，胶原原纤维稀疏、松散，局部点状变性(标尺=2μm)

图10.成纤维细胞坏死，周边胶原原纤维断裂、扭曲，排列稀疏、松散，部分缺失(标尺=2μm)

图11.对照组:胶原原纤维排列整齐、紧密，无扭曲、变性、坏死，成纤维细胞核卵圆，胞质细胞器丰富(标尺=2μm)

图12.对照组:成纤维细胞核卵圆，胞质细胞器丰富，线粒体数量不多，细胞周边有长胞突，周围胶原原纤维整齐排列(标尺=2μm)

2 讨论

结膜松弛症是年龄相关性老年人常见眼病，随着人口老龄化加快，结膜松弛症患病人群将日趋增多［1，4-5］。但是结膜松弛症的发生、发展、治疗及预防等许多问题需要进一步研究。我们对一个结膜松弛症病例采用目前先进的研究方法系统研究，以期相互验证，发现新问题。

结膜松弛症松弛球结膜堆积在眼球，与下睑缘、内、外眦部之间形成皱褶，突出于眼表曲面，影响泪液的流动、分布、排泄，泪河变窄或残缺不全，泪液不能正常流动到泪湖区，泪湖不能聚泪，泪液不能进入泪小点，使泪液排泄出现障碍;松弛结膜皱褶也影响瞬目等眼表泪液功能，引起眼部干涩、异物感、溢泪、刺痛、灼痛感等症状。结膜松弛症缺乏有效的药物治疗，如果结膜松弛症引起的干涩、异物感、溢泪、视物模糊、视疲劳、疼痛等症状明显;裂隙灯显微镜检查球结膜过度松弛成皱褶堆积在下睑缘、内、外眦部之间，影响泪河，堵塞泪小点;结膜松弛症分级≥Ⅱ级，经规范药物等保守方法治疗3个月无明显效果，为手术适应证［2］。结膜新月形切除术是手术治疗结膜松弛症的主要方法［2］。新月形切除堆积在睑缘上的松弛结膜，解除了松弛结膜对眼表的刺激症状，使泪河的解剖部位恢复正常;解除了松弛结膜对泪小点的堵塞，泪液排出恢复，眼瞬目恢复正常，患者症状解除。

如何客观评价在结膜松弛症手术中观察到的球结膜基质变薄、Tenon筋膜萎缩，球结膜与筋膜与巩膜的黏合力下降，未见文献报道。新一代OCT出现后，我们尝试在离体猪眼用OCT测量球结膜结构取得意外结果，并在青光眼小梁切除术的病例中预置调节缝线标记在结膜与筋膜之间，用OCT观察球结膜得到球结膜与筋膜的分界线标志，重复性好，并与手术中的实际观察相一致［3］。OCT扫描结膜松弛症病例球结膜上皮层面凹凸不平，上皮细胞层与结膜固有层结合疏松，固有层和筋膜变薄，球结膜厚度(136μm)变薄与对照组球结膜厚度(236μm)比较差异明显，与手术中观察到结膜松弛症病例球结膜变薄、筋膜萎缩相一致，在活体上客观测量了球结膜厚度。

本病例手术切除的松弛结膜组织用HE染色、Verhoeff弹力纤维染色、Masson三色染色和Mallory磷钨苏木素染色观察:结膜松弛症的结膜病理表现为结膜弯曲皱褶，鳞状上皮增生，厚薄不均，角化不全;固有层变薄，弹力纤维明显减少，几乎消失，胶原纤维融解坏死。与研究者［6-7］报道的结膜松弛症球结膜固有层中胶原纤维融解、弹力纤维的减少结果相一致。结膜松弛症的球结膜上皮层杯状细胞较少，与以前报道［8］一致。球结膜基质层主要由纤维组织和结缔组织构成，结膜松弛症病例球结膜固有层胶原纤维融解、弹力纤维的减少使得球结膜变薄，弹性下降，从组织病理学的角度进一步支持了OCT的检查结果。

我们曾在结膜松弛症泪液中发现炎症反应相关蛋白质和防御素［9］，结膜松弛症泪液中细胞因子检测发现 TNF-α、IL-6、IL-8含量高［10］。这些都提示结膜松弛症的发生可能与炎症反应有关。共聚焦显微镜观察到结膜松弛症上皮细胞层内朗格汉斯细胞增多，进一步说明了结膜松弛症的发生与炎症有关。共聚焦显微镜观察球结膜固有层纤维稀疏不规则、稀疏，与组织病理学结果和电镜观察结果一致。

2003年我们曾报道用透射电镜对结膜松弛症患者球结膜组织的超微结构进行对比观察，结膜松弛症组的成纤维细胞胞质中有较多中等程度扩张的粗面内质网和游离核糖体，胞质外周区有较多衣小泡和吞饮泡［11］。本病例手术切除的松弛结膜在透射电镜下观察，固有层胶原原纤维稀疏、松散，局部点状变性;成纤维细胞坏死，周边胶原原纤维断裂、扭曲，排列稀疏、松散，部分缺失。本结果进一步支持了组织病理学和共聚焦显微镜检查结果。

结膜松弛症的发病机制可能是由于基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1，MMP1)、MMP3 的过度表达，使mmP与基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)的平衡失调［12-13］，引起胶原纤维融解，弹力纤维变性，导致球结膜基质和Tenon囊的过度降解，球结膜变薄，筋膜萎缩，松弛结膜堆积在下睑缘、内眦部、外眦部之间形成皱褶，引起眼表泪液学的异常病理循环，而发生结膜松弛症。

本例结膜松弛症患者研究从手术中组织形态观察、OCT、共聚焦显微镜、组织病理学、透射电镜5个方面进行系列观察，相互验证，为结膜松弛症的发病机制提供了新的依据。

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