陈钦进 吴强 倪爱平 周俊 周丹

青光眼是一种以病理性眼压升高、视盘凹陷病理性扩大、特征性视野损害为主要特征的致盲性眼病，具有视功能损害不可逆转和“继发性损害”的特点。青光眼视网膜神经节细胞死亡的方式是神经节细胞凋亡［1］。在细胞凋亡的研究中，caspase-3受到越来越多的重视。眼压在青光眼的病程中起着十分重要的作用，我们在研究缺氧诱导因子(hypxia-inducible factor 1α，HIF-1α)的过程中发现，不同高眼压及其持续时间对大鼠视网膜caspase-3的表达有不同影响，故借以探讨高眼压时视网膜神经节细胞凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 正常Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄不限，9～10周龄，体质量180～220 g，购自中国科学院上海动物实验中心，清洁级。动物使用遵守美国眼科与视觉研究协会(ARVO)有关实验动物的使用条款。所有大鼠均在12 h明光/12 h暗光的环境中饲养，环境温度为22～25℃，湿度为55%～60%。

1.2 大鼠急性高眼压模型的制备和分组 采用前房灌注法制作大鼠高眼压模型［2］。第一部分:高眼压持续时间相同(4 h)，将60只SD大鼠随机分为正常对照组、40mm Hg(1mm Hg=0.133 kPa)组、60mm Hg 组、80mm Hg组、100mm Hg组，每组12只;正常对照组只进行前房穿刺，其他各组采取前房灌注平衡盐液的方法分别给予不同的眼压。第二部分:眼内压力相同(80mm Hg)，将48只SD大鼠随机分为正常对照组、2 h组、4 h组、8 h组;正常对照组只进行前房穿刺，其他各组眼内压持续时间各不相同。涉及眼内的操作均遵守无菌操作规程。各组每只大鼠随机选择一只眼灌注，灌注过程中选择台式血压计全程监测眼内压［2］。

1.3 Western印迹检测 每组取8只大鼠，提取视网膜总蛋白，用Lowry法进行总蛋白质定量，运用Biorad垂直电泳系统和聚丙烯酰胺凝胶电泳(10%分离胶和5%浓缩胶);各泳道上样总蛋白80 μg，分离胶电压为150 V，浓缩胶电压为100 V，在溴酚蓝离开分离胶20min后停止电泳;依据蛋白标准(7708 V，纽英伦生物技术有限公司)取含有目的蛋白和内参蛋白的胶条;转膜采用全湿法进行，恒流350 mA转移2 h;一抗浓度为1∶1000(兔抗鼠多克隆，Santa Cruz公司，美国)，二抗浓度均为1∶300(山羊抗兔多克隆，PIERCE公司，美国)。同时检测内参蛋白β-actin的表达(一抗1∶5000，小鼠抗大鼠单克隆，Sigma公司，美国;二抗1∶300，同上)，一抗均4℃过夜，二抗置室温摇晃2 h;加ECL，摄片，通过图像分析系统获得目的蛋白和参考蛋白的表达灰度。

1.4 免疫组织化学检测 实验结束后各组处死4只大鼠，迅速摘取眼球，置入10%中性甲醛固定液中，24 h后经梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片(片厚约5μm)。常规脱蜡、水化、抗原修复;加入一抗(抗caspase-3抗体，1∶100;Santa Cruz公司，美国)后4 ℃孵育过夜;用1×TBS洗去一抗，加入二抗(1∶100，PIERCE公司，美国)室温下孵育45min;再洗去二抗，加入新鲜配制的二甲基邻苯胺显色液;充分水洗，终止反应;苏木素复染1min;烤干，中性树脂封片，光学显微镜下观察摄像。

1.5 统计学处理 用凝胶图像分析仪扫描照片后，用目的蛋白的表达灰度与内参蛋白表达灰度的比值表示目的蛋白的表达相对量。所有计量资料都采用均数±标准差表示，采用SPSS 17.0统计软件包进行方差分析(ANOVA)并做Dunnett-t检验，组内两两比较采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 眼内压对大鼠视网膜caspase-3表达的影响 正常对照组、40mm Hg组、60mm Hg组、80mm Hg组和100mm Hg组的caspase-3蛋白条带灰度与相应βactin灰度比值分别为 1.15 ±0.04、1.16 ±0.06、1.56 ±0.05、1.73 ± 0.057、1.74 ± 0.079。统计分析结果显示:40mm Hg组与正常对照组大鼠视网膜caspase-3的表达差异无统计学意义(q=0.50，P=0.621);60mm Hg组、80mm Hg组和100mm Hg组大鼠视网膜caspase-3表达显著高于对照组(q值分别为4.87、5.28和6.71，P 值均为0.000);60mm Hg组与 80mm Hg组和100mm Hg组大鼠视网膜caspase-3的表达差异无统计学意义(q值分别为0.41和1.84，P值分别为0.687 和0.081);80mm Hg组和100mm Hg组之间大鼠视网膜caspase-3的表达差异无统计学意义(q=1.43，P=0.168)(图1)。

图1.高眼压对caspase-3表达影响的Western印迹分析结果

2.2 高眼压持续时间对大鼠视网膜caspase-3表达的影响 正常对照组、2 h组、4 h组和8 h组大鼠视网膜caspase-3蛋白条带灰度与相应β-actin灰度比值分别为:1.137 ±0.09、1.139 ±0.09、1.278 ±0.11、1.319 ±0.11。统计分析结果显示:与正常对照组相比，2 h组大鼠视网膜caspase-3表达无显著增加(q=0.04，P=0.966)，4 h组和8 h组大鼠视网膜caspase-3的表达显著高于正常对照组(q值分别为2.81和3.67，P值分别为0.013和0.002);4 h组和8 h组大鼠视网膜caspase-3的表达差异无统计学意义(q=0.86，P=0.405)(图 2)。

2.3 实验各组视网膜caspase-3的免疫组织化学检测结果 实验各组大鼠视网膜可见部分细胞caspase-3免疫组织化学法检查呈阳性染色，为棕色或棕黑色着色。着色部位主要是细胞核内，核仁未着色，着色细胞位于外丛状层、内丛状层靠近内核层区域和神经节细胞层，偶见内丛状层中间部位着色，但着色细胞走向为从内核层向神经节细胞层，内核层、外核层及视杆视锥层没有明显着染。与正常对照组相比，60mm Hg组、80mm Hg组和100mm Hg组染色细胞数较多，以100mm Hg组染色最明显;与正常对照组相比，2 h组着色无明显增强，4 h组和8 h组着色明显增强，但4 h组和8 h组着色无明显差异(图3)。

图2.高眼压持续时间对caspase-3表达影响的Western印迹分析结果

图3.高眼压及持续时间对caspase-3表达影响的免疫组织化学检测结果

3 讨论

caspase是一个半胱氨酸蛋白酶家族，具有在天冬氨酸后进行酶切的特性，在细胞凋亡的过程中起着关键性作用。目前已发现14种哺乳动物的caspase，这些酶以休眠的酶原状态存在，在特定的条件下经过处理变为有催化活性的成熟酶。基于底物特异性和细胞功能，caspase可分为3 个组，即炎症组(caspase 1、4、5、11、12、13、14)、凋亡起始组(caspase 6、8、9、10)和凋亡效应组(caspase 2、3、7)。细胞凋亡是复杂的caspase家族引导的一个蛋白酶级联反应过程，尽管在不同的细胞或不同信号传导途径诱发的凋亡过程中，参与的caspase有所不同，但caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路［3-4］，也是凋亡的关键酶和执行者。

本实验发现，正常对照组大鼠视网膜有一定caspase-3的表达，而且正常大鼠表达caspase-3的细胞定位与高眼压大鼠表达caspase-3的细胞定位完全相同，证实正常大鼠视网膜也存在细胞凋亡的过程，并且高眼压时大鼠视网膜细胞凋亡与正常大鼠视网膜细胞凋亡的效应细胞在视网膜的位置是相同的。本实验还发现，随着眼压一定程度的升高和高眼压持续时间的延长，大鼠视网膜caspase-3的表达进一步增加，提示高眼压时相关视网膜细胞的凋亡活动进一步增强，可能造成更多的视网膜神经节细胞和其他相关细胞的凋亡，从而引起视力损害。一些实验证明某些药物可以逆转高眼压时大鼠视网膜caspase-3的表达增加，Kamalden等［5］证实当大鼠眼压升高达120mm Hg时，caspase-3的表达明显上调，并且这种上调可以被药物所改善。Sun等［6］在研究中发现眼压升高(130mm Hg)后，视网膜 caspase-3、p53和 Bcl-xl等表达上调，而原卟啉钴可以通过促进血红素加氧酶的表达来阻止这些上调;但是，高眼压时caspase-3的表达明显上调的机制还不是很明确。

目前，国内外采用前房灌注生理盐水方法来建立急性青光眼模型时，眼内压往往在100mm Hg以上［5-7］。我们在研究高眼压条件下缺氧诱导因子1α的表达过程中，要求高眼压持续时间约为4 h;同时发现眼压超过80mm Hg时，HIF-1α的表达并没有继续增加，而本实验是缺氧诱导因子研究的一部分，研究表明在相同的灌注时间内，前房灌注压力为60mm Hg、80mm Hg和100mm Hg时caspase-3的表达没有明显差异，而在实际造模过程中眼内压过高时，往往造成灌注液从穿刺口液渗漏，从而导致眼内压不稳;况且，研究高眼压大鼠视网膜caspase-3表达的意义在于研究人的青光眼，研究［8］表明大鼠正常的眼内压与人正常的眼内压相似，但人患青光眼时眼内压一般在80mm Hg以下;再有，过高的眼内压可能造成视网膜坏死而不是凋亡，所以在采用前房灌注方法建立大鼠高眼压模型研究 caspase-3时，建议眼内压保持在80mm Hg为宜。本研究表明眼内压为80mm Hg，高眼压持续时间为2 h时caspase-3的表达无明显上调，高眼压持续时间为4 h时caspase-3的表达明显上调，增加高眼压持续时间，caspase-3表达的进一步上调不明显，而增加高眼压持续时间可能会增加大鼠的死亡、眼内压不稳等风险，提示研究高眼压大鼠视网膜caspase-3的表达时，高眼压持续时间选定4 h较为适合。所以，采用前房灌注平衡盐液制作急性青光眼模型研究高眼压大鼠视网膜caspase-3的表达时，眼内压为80mm Hg、高眼压持续时间为4 h较为适合。

［1］Quigly HA，Nickells RW，Kerrigan LA，et al.Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1995，36(5):774-786.

［2］陈钦进，管怀进，解正高，等.台式血压计监测大鼠急性高眼压模型建立过程中的眼内压［J］.中国眼耳鼻喉科杂志，2007，7(4):211-213.

［3］Cohen GM.Caspase:the executioners of apoptosis［J］.Bio Chem，1997，326(1):1-16.

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［5］Kamalden TA，Ji D，Fawcett RL，et al.Genistein blunts the negative effect of ischeamia to the retina caused by an elevation of intraocular pressure［J］.Ophthalmic Res，2011，45(2):65-72.

［6］Sun MH，Pang JH，Chen SL，et al.Retinal protection from acute glaucoma-induced ischemia-refusion injury though pharmacologic induction of Heme Oxygenase-1［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51(9):4798-808.

［7］陈芝清，姚克，徐雯，等.E-64d对大鼠视网膜缺血再灌注损伤中Calpain和caspase-3表达的调控作用［J］.眼科研究，2007，25(1):44-48.

［8］马建洲，谢琳，贺翔鸽，等.正常大鼠麻醉状态下的眼压分布规律［J］.中国临床康复，2005，9(2):115-117.