宋康 孙绮蛮 周俭 黄晓武 史颖弘 肖永胜 谭长军 高强 何义舟 成剑文 杨柳晓 樊嘉

（复旦大学附属中山医院肝外科，上海 200032）

部分肝移植已成为目前治疗各类终末期肝病的有效手段，它的开展使得当前供肝缺乏的现状得以缓解。然而，移植肝在手术过程中不可避免地经历了缺血再灌注，这是造成术后移植肝功能不良的重要因素。线粒体膜上存在对ATP浓度敏感的钾离子通道－－mitoKATP （mitochondrial ATP－sensitive potassium channels），其活性不仅可以被ATP抑制，也可以被 5－羟基癸酸盐 （5－hydroxydecanoate sodium salt，5－HD）和磺脲类药物特异性关闭［1］，而二氮嗪（diazoxide，DA）则能特异性开放该通道［2］。目前国内外有关mitoKATP对肝脏的缺血再灌注损伤影响的研究很少。本研究在大鼠60%比例部分肝移植术前采用DA预处理供体，观察DA对大鼠部分肝移植中缺血再灌注损伤的保护作用。

1 资料与方法

1.1 实验动物与分组 由中国科学院上海实验动物中心提供的清洁级雄性SD（Sprague－Dawley）近交系大鼠，体质量220～300g，分笼饲养，予标准饲料，自由饮水。将150只大鼠随机配成75对，并分为3组：对照组（C组）、DA预处理组（DA组）、5－HD＋DA预处理组（HD－DA组），每组25对。每对大鼠中，供体体质量应比受体轻10～20g。

1.2 动物实验术前准备 供、受体术前均禁食12 h，自由饮水。受体术前30min肌注阿托品0.03 mg。术前将大鼠置于充满乙醚气体的封闭容器中3～5min麻醉，术中乙醚持续开放麻醉。供、受体手术均由2名医师完成操作。C组术前供体不进行药物预处理；DA组供体在术前30min腹腔注射DA（5mg／kg）；HD－DA组供体在术前45min腹腔注射5－HD（5mg／kg），15min后腹腔注射 DA（5 mg／kg）。

1.3 供体手术 从阴茎背静脉注入含肝素的0.9%氯化钠液2mL（肝素浓度：50U／mL），取腹部大“十”字切口进腹。剪开肝镰状韧带，确认肝上下腔静脉无变异后，用0.9%氯化钠液浸湿的纱布覆盖肠管并推向左侧腹部。游离肝下下腔静脉，将右肾静脉与右肾动脉分离，分别结扎右肾静脉和右肾上腺静脉。插入胆道插管至左、右肝管会合部稍下方，结扎固定。游离尾状叶，于根部结扎后将其切除。结扎肝食管交通支，缝扎左隔下静脉。缝扎并结扎左外叶根部后切除左外叶。游离腹主动脉，向近心端穿刺输液针，迅速剪开右侧部分膈肌，阻断胸主动脉，于右心耳水平剪断肝上下腔静脉，于左肾静脉水平剪断肝下下腔静脉，建立流出道；用0～4℃乳酸林格氏液（含肝素25U／mL）以2.5mL／min的速度持续重力灌注，灌注高度50cm。待肝脏灌注充分，呈均匀黄白色后，分离肝周韧带。解剖门静脉，分离、切断肝动脉，结扎并切断胃冠状静脉、脾静脉，在距脾静脉下2mm处切断门静脉，随后停止灌注。迅速切断肝后韧带和肝上下腔静脉膈肌环，取出肝脏置于器官修整皿中，在0～4℃乳酸林格氏液中保存。

1.4 供肝修整 剔除肝下下腔静脉以及门静脉周围的结缔组织和脂肪组织，分别套管。剪开膈肌环膜，沿膈肌环剪除膈肌，在肝上下腔静脉左右两侧角分别预置7－0缝线。

1.5 受体手术 采用正中切口进腹，剪开肝镰状韧带，确认肝上下腔静脉无变异后，用0.9%氯化钠液浸湿的纱布将肠管推向左下腹部。缝扎左隔下静脉，结扎肝食管交通支。游离肝下下腔静脉至右肾静脉，结扎右肾上腺静脉。分离肝周组织、肝后韧带至膈肌环，游离肝上下腔静脉。于第一肝门分离胆总管，在左右肝管分叉水平结扎并切断胆总管。缝扎并切断肝动脉。分离门静脉至左右支分叉处。用无创血管夹分别于右肾静脉上方和胃冠状静脉上方阻断肝下下腔静脉和门静脉，然后停止吸入乙醚。于门静脉左右支分叉处穿刺，快速注入常温乳酸林格氏液约2mL，以排尽肝内血液。分别缝扎门静脉左、右支，保留缝线用无创血管钳两侧牵引。用Satinsky钳阻断肝上下腔静脉，贴近肝脏剪断肝上下腔静脉。于门静脉左右支结扎线肝侧剪断门静脉。剪断肝下下腔静脉，移除受体肝脏。将供肝原位放入腹腔，在供肝表面覆盖含0～4℃保存液的湿棉片予以低温保护。在供肝肝上下腔静脉两侧角的预置缝线与受体相应位置缝合打结，连续缝合后壁和前壁。用含肝素的0.9%氯化钠液分别冲洗受体和供肝门静脉腔。将供肝门静脉套管套入受体门静脉内，结扎固定于套管刻槽内。移除无创血管夹，开放门静脉血流，肝脏迅速恢复血供，呈暗红色。待肝下下腔静脉有血液流出时，用无创血管夹阻断肝下腔静脉，并移除阻断受体肝上下腔静脉的Satinsky钳。同门静脉吻合的方法，将供肝下腔静脉套管套入受体肝下下腔静脉内，结扎固定于套管刻槽内。将供肝胆道支架管插入受体胆总管，结扎并固定。用无菌棉球擦净腹腔积液，分层间断缝合切口。

1.6 术后处理 术后大鼠活动自如时，将其移入单笼饲养。手术当天禁食，术后自由饮水，第2天起予标准饲料进食。均未予以补液及抗生素、免疫抑制剂治疗。

1.7 标本采集 于术后2h、1d、3d、5d和7d，将每组大鼠各处死5只并在无菌条件下取材。在血供未断的条件下，用预冷的锋利剪刀快速剪下一小块肝组织，将其浸泡在0～4℃的2.5%戊二醛溶液中；用预冷的刀片修整剪切的断面，把组织切成一薄片，再切成7～8个小块，大小约1mm3；用棉签迅速将其转移到盛有预冷的2.5%戊二醛溶液的标本瓶中，置于冰箱4℃保存。经腹主动脉穿刺缓慢匀速抽血，采血5～10mL，4℃离心（3000r／min，20 min）后取上清，放入－80℃冰箱保存。取血后，切取约1cm3大小的肝组织，将其浸入10%甲醛溶液中固定，24h后放入30%乙醇中固定，然后进行石蜡包埋、切片。

1.8 检测指标 在光镜下进行HE染色病理检查，在透射电镜下进行超微结构检查，用全自动生化分析仪测定谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）。

1.9 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差（¯x±s）描述，组间数据的比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 光镜检查 DA组移植术后肝细胞的肿胀变性坏死及空泡样变性、肝小叶结构排列的紊乱和汇管区的炎症显著轻于C组，而HD－DA组术后的肝损伤情况与C组相仿。

2.2 电镜检查 术后C组和HD－DA组可见细胞间隙明显增宽，窦间隙显著扩张，线粒体肿胀明显，线粒体嵴减少或消失，内质网扩张并有包裹线粒体现象，微绒毛丧失，Kupffer细胞侵入肝实质，吞噬活跃，局部见坏死区；而DA组的细胞结构完整，线粒体肿胀及细胞间隙扩张程度较轻，肝窦无扩张，Kupffer细胞活跃度低，吞噬体不多见。见图1和图2。2.3 肝功能指标测定 3组的ALT和AST值均在术后1d达到峰值，随后逐步下降，至术后7d达到最低值。见表1和表2。

表1 各组术后ALT（U／L）比较

表2 各组术后AST（U／L）比较

3 讨 论

组织的缺血再灌注损伤与线粒体能量转换障碍、氧自由基产生增加、细胞内钙超载、细胞因子等炎性介质的异常释放等有关［3］。DA预处理可以对缺血再灌注损伤起保护作用，是由于位于线粒体膜上的mitoKATP通道对DA的敏感性几乎是位于细胞膜上的KATP通道对DA的敏感性的2 000倍［4］。

本研究对大鼠进行60%比例部分肝移植术后，病理检查结果显示C组和HD－DA组均出现严重的肝小叶结构紊乱、肝细胞的空泡样变性和坏死以及大量的炎症细胞侵润；电镜观察也发现肝细胞结构的完整性被破坏、细胞间隙增宽、窦间隙显著扩张，线粒体和内质网明显扩张、线粒体嵴减少消失及空泡样变，微绒毛丧失，淋巴细胞侵入肝实质，局部见坏死区、巨噬细胞吞噬活跃以及凋亡。DA组肝细胞及其细胞器的损伤程度显著轻于其他2组。ALT和AST均在术后1d达到高峰，随后逐步下降。DA组术后2h—3d的ALT和AST均显著低于C组和HD－DA组 （P＜0.05）。本研究结果表明DA预处理可以改善部分肝移植术后的缺血再灌注损伤，但DA的保护作用可以被5－HD阻断。

由于移植肝的缺血再灌注损伤是一个非常复杂的病理生理过程，涉及多种细胞、细胞因子间的互相作用及调控，DA预处理改善缺血再灌注损伤的机制有待于进一步研究。

［1］ Hu H，Sato T，Seharaseyon J，et al.Pharmacological and histochemical distinctions between molecularly defined sarcolemmal KATP channels and native cardiac mitochondrial KATP channels［J］.Mol Pharmacol，1999，55（6）：1000－1005.

［2］ Inoue I，Nagase H，Kishi K，et al.ATP－sensitive K＋channel in the mitochondrial inner membrane［J］.Nature，1991，352（6332）：244－247.

［3］ Shinoda M，Shimazu M，Wakabayashi G，et al.Tumor necrosis factor suppression and microcirculatory disturbance amelioration in ischemia／reperfusion injury of rat liver after ischemic preconditioning［J］.J Gastroenterol Hepatol，2002，17（11）：1211－1219.

［4］ Garlid KD，Paucek P，Yarov－Yarovoy V，et al.Cardioprotective effect of diazoxide and its interaction with mitochondrial ATP－sensitive K＋ channels.Possible mechanism of cardioprotection［J］.Circ Res，1997，81（6）：1072－1082.