顾金萍 陶俊 范建霞

（上海交通大学附属国际和平妇幼保健院，上海 200030）

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是女性最常见的内分泌与生殖功能障碍性疾病，育龄妇女PCOS的患病率约为10%［1］。PCOS病因复杂，可能受遗传和环境因素共同影响。肥胖相关基因（fat mass and obesity associated gene，FTO）与PCOS发病具有非常密切的关系［2］。在基因组变异中，单核苷酸多态性（single nucleotide polymophism，SNP）是一种主要形式。已有研究［3］显示PCOS人群FTO基因的SNP与其发病存在关联。本研究探讨PCOS患者的子代是否也具有上述FTO杂合性变异。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2009年6月—2011年4月在上海交通大学附属国际和平妇幼保健院定期产检并分娩的孕妇55例，其中28例PCOS治疗后孕妇为研究组（PCOS组）（诊断标准严格遵照2003年鹿特丹标准）；另27例为年龄、体质量指数（body mass index，BMI）与研究组匹配的健康产妇为对照组。研究组平均年龄（28.63±2.39）岁，对照组平均年龄（28.87±3.18）岁，两组平均年龄无显著差异（P＝0.78）。PCOS组孕前平均BMI（23.79±3.42）kg／m2，对照组孕前平均BMI（24.06±3.45）kg／m2，两组孕前平均BMI无显著差异（P＝0.776）。

1.2 实验方法

1.2.1 胎盘组织 DNA抽提 （1）将200μL胎盘组织中加入400μL细胞裂解液混匀，再加入6μL蛋白酶K混匀，置于55℃水浴20min，期间混匀几次；（2）加入600μL氯仿后充分混匀；（3）12 000r／min，室温离心2min。离心管内液体呈3层，基因组DNA在上层中，取上层清液500μL，置于无菌1.5mL离心管中；（4）加入500μL沉淀液后混匀，室温放置2min后以12 000r／min，离心2min；（5）弃上清，立即加入100μL的1.2mol／L氯化钠溶液，轻轻振荡直至DNA样品完全溶解，加入2μL RNA酶，置于37℃10min；（6）加入300μL冰冷乙醇，－20℃放置10min后以12 000r／min，离心5～8min，离心后吸走或倒掉乙醇，用70%乙醇洗1次，倒置室温干燥10min。然后加入100μL TE溶解DNA。

1.2.2 引物设计及PCR引物设计见表1，扩增成功的PCR产物采用2%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶电泳成像分析仪上观察结果；然后将目的条带用ABI Prism 7900HT序列检测系统进行纯化测序，并对测序结果进行分析。

表1 检测FTO基因rs1421085（C／T）位点SNP的引物序列

1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0软件分析。计数资料以频数与百分率表示，组间比较采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 FTO基因rs1421085（C／T）PCR产物电泳结果 见图1。如图中所示，第13～25泳道条带与标志物位置对比在250bp与500bp之间且靠近500 bp处。而1～12泳道与标志物位置对比显然与第13～25泳道有异，故切下条带，继续测序，进一步明确基因型的差异。

图1 FTO基因rs1421085电泳结果

2.2 PCR产物的测序结果及分析 对55例孕妇胎盘组织中的FTO基因rs1421085（C／T）PCR产物测序分析后，发现该位点共出现3种基因型，分别为T／T、T／C和C／C基因型。其中T／T基因型共有45例（19例出现在PCOS组，26例出现在对照组），T／C基因型共有8例（7例出现在PCOS组，1例出现在对照组），C／C基因型共有2例（2例均出现在PCOS组）。

2.3 FTO基因rs1421085（C／T）位点的基因型频率 2组等位基因频率比较，具有显著差异（χ2＝7.2160，P＝0.0072）。2组基因型频率比较，具有显著差异（χ2＝4.800，P＝0.0285）。

表2 等位基因频率及基因型频率比较［n（%）］

3 讨 论

FTO基因定位于人类16号染色体长臂，包含9个外显子，410 507个碱基。FTO基因在胎儿以及成人组织中广泛表达，尤其在下丘脑、垂体、肾上腺组织和胰岛细胞中表达水平较高。研究［4］发现，FTO与肥胖及肥胖相关疾病如2型糖尿病、代谢综合征的发生相关。携带有FTO危险基因型的个体，体质量明显较大，并且伴有糖耐量下降、胰岛素抵抗等内分泌紊乱及代谢综合征。Gerken等［5］认为，FTO基因催化活性可能是通过去甲基化的机制调节基因的转录，进而影响肥胖；也可能是与其同源蛋白ABH2一样，FTO蛋白充当核酸修复酶的作用。FTO基因的变异可能损伤了基因组的修复过程，从而导致肥胖和代谢综合征。

本研究收集了PCOS孕妇和正常孕妇胎儿的胎盘组织，分离其基因组DNA，并针对FTO基因SNP位点设计特异性的PCR引物进行扩增。通过PCR产物测序及序列对比，结果显示正常孕妇胎盘组织FTO基因rs1421085（C／T）SNP基因型以“T／T”为主，而在PCOS孕妇胎盘组织中，FTO基因rs1421085（C／T）SNP位点杂合性突变主要表现为“TT→TC”或“TT→CC”。当FTO基因的SNP位点发生变异时，原本编码的氨基酸突变成另一种氨基酸，从而导致其最终蛋白质产物出现功能性差异。由此推测，PCOS孕妇子代FTO基因SNP位点的变异率比正常孕妇分娩的胎儿高，PCOS患者子代具有PCOS及肥胖等代谢综合征的再发风险。

［1］ Goodarzi MO，Dumesic DA，Chazenbalk G，et al.Polycystic ovary syndrome：etiology，pathogenesis and diagnosis［J］.Nat Rev，2011，7（4）：219－231.

［2］ Tan S，Scherag A，Janssen OE，et al.Large effects on body mass index and insulin resistance of fat mass and obesity associated gene（FTO）variants in patients with polycystic ovary syndrome（PCOS）［J］.BMC Med Genet.2010，11：12.

［3］ Barber TM，Bennett AJ，Groves CJ，et al.Association of variants in the fat mass and obesity associated（FTO）gene with polycystic ovary syndrome［J］.Diabetologia，2008，51（7）：1153－1158.

［4］ Wang T，Huang Y，Xiao XH，et al.The association between common genetic variation in the FTO gene and metabolic syndrome in Han Chinese［J］.Chin Med J （Engl）.2010，123（14）：1852－1858.

［5］ Gerken T，Girard CA，Tung YC，et al.The obesity－associated FTO gene encodes a 2－oxoglutarate－dependent nucleic acid demethylase［J］.Science，2007，318（5855）：1469－1472.