李鹏飞，吕慧娜，韩立波

(1辽宁省肿瘤医院，沈阳110042;2中国医科大学附属盛京医院;3中国医科大学附属第一医院)

Oct4是具有代表性的胚胎干细胞转录因子，它是 转录因子POU家族的一员，不但在胚胎于细胞、胚胎生殖细胞、胚胎和生殖肿瘤细胞中表达，亦在一些成人组织的祖细胞和原发肿瘤中表达［1］。Sox2，性别决定区因子，与Oct4一同在胚胎干细胞维持自我更新及多向性发展过程中起着决定性的作用，是维持胶质瘤祖细胞增殖和遗传特性的关键转录调节因子，研究发现Sox2以致癌基因的形式在多种肿瘤中表达［2］。这些基因特异性的表达于这个独特的人类生命周期阶段，而不表达于体细胞，可能对癌症的治疗有着潜在的巨大潜力。目前国外的研究主要集中在Oct4、Sox2调节基因表达的能力方面，且研究对象多为细胞系，而在实体瘤方面研究很少。已经取得的研究结果表明Oct4、Sox2在部分胰腺癌、胃癌、乳腺癌及一些典型的肿瘤细胞系等中有一定程度的表达，并与肿瘤的发生有关［3～6］。关于Oct4、Sox2在肺癌组织中是否表达以及它们与肺癌进展及预后的相关性等问题目前尚未见报道。本实验采用免疫组化的方法，对132例肺癌组织、42例癌旁组织及34例正常肺组织进行Oct4、Sox2的表达检测，分析其表达情况和与病理类型、分化程度和临床分期及预后的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料 2002年9月～2008年5月在辽宁省肿瘤医院手术切除的肺癌组织标本132例。所有病例为初次发病，术前无化疗、放疗及免疫治疗史。其中男102例、女30例，年龄32～83岁、平均63.15岁。TNM标准分为:Tis～T1为7例，浸润性肿瘤，T2～T4为125例，42例癌旁组织标本取距癌灶0.5 cm处，34例正常肺组织远离癌灶5 cm处，有淋巴结转移者52例，无淋巴结转移者80例。标本均经病理证实。并以34例正常肺组织作对照，病理检查证实是正常肺组织。兔源性Oct4、Sox2多克隆抗体购自Abcam公司，链霉卵白素-生物素过氧化物酶(SP)标记的二抗试剂盒及DAB均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。其他生化试剂采用国产分析纯。

1.2 免疫组织化学检测 采用链霉素抗生素蛋白—过氧化物酶(SP)法，步骤如下:组织标本用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，切片厚4 mm。切片常规脱蜡、水化，水浴法进行抗原修复，修复后的切片用3%双氧水阻断内源性过氧化物酶活性。用正常血清孵育封闭内源性非特异性抗原，滴加Oct4、Sox2多克隆抗体(工作浓度均为1∶200)，4℃过夜。滴加二抗(采用抗兔SP试剂盒)，DAB显色，苏木素复染，封片。磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗为空白对照，正常肺组织作为阴性对照。结果判断:光镜下观察，Oct4、Sox2抗原阳性反应为位于细胞核内出现黄色、棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性细胞。由染色深浅和阳性细胞所占百分比一起决定阳性反应强度，判断标准是每张切片随机选取5个高倍视野(×400)，每个视野数100个细胞，先按阳性细胞所占百分比评分:≤5%为0，6%～25%为1，26%～50%为2，51%～75%为3，≥76%为4;再按染色强度评分:不着色为0，淡黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3。最后按两者乘积数将每个标本的表达强度分为4个等级:阴性(-)l级(0、1、2);弱阳性(+)2级(3、4);中度阳性(++)3级(6、8);强阳性(+++)4级(9、12)。

1.3 统计学方法 应用Prism5.0统计软件分析，数据以s表示，阳性率之间的比较采用χ2检验，多组间比较采用方差分析。以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 Oct4、Sox2表达及与临床病理特征关系 Oct4和Sox2在肺癌中均高表达，阳性产物呈棕黄色颗粒，Sox2主要表达于腺体的细胞质，Oct4在胞质及胞核内均有表达。在34例正常肺组织中表达全部阴性，在132例肺癌中，Oct4阳性93例，Sox2阳性62例，阳性表达率70.45%和46.96%，在癌旁组织中阳性率为21.87%和30.22%，各组比较差异有统计学意义(P＜0.05);在132例肺癌中，Oct4和Sox2在不同肿瘤分级之间(T1～T4)的阳性表达率分别为5.34%和10.61%、15.97%和13.66%、43.18%和45.45%、87.50%和100.00%，组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。Oct4、Sox2蛋白表达强度随着与肿瘤的病理学分级增高而降低，呈负相关关系(P＜0.05)，而与患者的年龄、性别、分化程度无明显相关性(P＞0.05)。

2.2 生存分析 在Oct4、Sox2与患者5年生存率的单因素分析中，Oct4和Sox2的单独阳性表达患者的5年总生存率为40.2%和24.8%，Oct4和Sox2的单独表达并不能作为判断预后的独立因素(P=0.328和P= 0.171)，而他们的联合表达，均阳性或均阴性的5年生存率为80.2%和21.3%，则可以作为判断肺癌预后的独立因素(P＜0.001)。TNM分期对于评估肺癌预后具有重要意义，为了找出能够更准确预测肺癌术后患者生存质量的分子标记物，我们通过多因素分析研究了Sox2和Oct4蛋白在不同TNM分期中的预后价值，多因素分析中，肿瘤分化程度、TNM分期为预后因素，Sox2和Oct4均阳性是明显的独立预后因素(P= 0.001)，Kaplan-Meier生存分析同样支持上述结论，Sox2和Oct4表达均为阳性的患者生存率低于Sox2和Oct4均为阴性表达的患者(P＜0.01)。见图1。

3 讨论

近年来，有很多研究表明干细胞的分子印迹可以作为很多肿瘤的预后分子标记物，Sox2和Oct4作为早期胚胎发育和维持胚胎干细胞特征所必须的转录因子，二者均在消化道器官发育和肿瘤的发生、发展中起着重要作用［7］，Sox2表达也见于腺上皮内瘤变和胰腺侵袭性导管癌［8］。Oct4在胃癌中表达高于癌旁组织、萎缩性胃炎和胃溃疡［9］。Sox2在胃癌中表达下调，通过促进细胞周期阻滞和凋亡而抑制细胞生长。Sox2在结肠息肉、黏液腺癌和印戒细胞癌中高表达，通过上调MuC5AC发挥作用［10］。对于直肠癌手术前放化疗的患者，Oct4、Sox2、CD133表达阳性对于直肠癌远处复发与预后不良有预警价值［11］。此外，Oct4和Sox2还参与中枢神经系统、呼吸道、泌尿生殖系统等多种肿瘤的发展［13～15］。本研究发现，Oct4与Sox2在肺癌组织中的表达明显高于其癌旁组织，Oct4与Sox2蛋白表达强度随着与肿瘤的病理学分级增高而降低，而与患者性别、年龄无关。

图1 Sox2和Oct4表达与肺癌患者5年生存率的关系

Sox2和Oct4在很多肿瘤高表达但在正常体细胞不表达，在食管癌和直肠癌表达分析表明Sox2与Oct4表达明显相关，进一步的研究发现 Sox2或Oct4过表达会导致肿瘤转移能力和恶化程度增加，与多种肿瘤不良预后相关，我们的研究亦发现Sox2或Sox2/Oct4可作为肺癌的独立预后因素，而Oct4不能作为生存率的独立预后因素，可能是与样本数不足有关，免疫组化结果确认了Sox2和Oct4的表达明显高于肺癌癌旁，而正常组织不表达，表明Sox2和Oct4均可能参与了肺癌的发生、发展过程。Oct4、Sox2可能是通过协同作用促进肿瘤的发生、发展，Oct4、Sox2特定的表达在多潜能细胞，除表达方式相似外，Oct4、Sox2有共同的结合位点，两者协作调控大多数的靶基因的表达。Oct4、Sox2结合到相邻的功能区，通过自身正反馈调控胚胎干细胞的多潜能性和自我更新能力。研究Oct4、Sox2功能机制不仅有利于多能干细胞技术的研究，为探讨肿瘤发生机制提供了一条新的思路，对未来研究诊断和治疗途径也具有十分重要的意义。

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