王 晗，符史干，董战玲，许闽广，王 杨，陈国斌，高凌峰

(海南医学院生理学教研室，海口571101)

缺氧诱导因子(HIF-1)是哺乳动物细胞在缺血/缺氧情况下产生的一种核转录因子，可促进下游缺氧反应基因如促红细胞生成素(EPO)、血管内皮生长因子(VEGF)、细胞周期素G2、血红素氧合酶-1 (HO-1)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等的表达，增强组织细胞抵抗缺血、缺氧的能力［1，2］。HIF-1由α亚基和β亚基组成，其中对HIF-1活性的调节主要通过α亚基。心肌营养素-1(CT-1)是新近发现的一种细胞因子，属于 IL-6超家族，可通过 JAK/ STAT3、MAPK-MEK/ERK、PI3-K/Akt等信号途径发挥保护心肌细胞的作用。缺氧时HIF-1与CT-1的关系尚不清楚，2010年1月～2011年4月我们检测了缺氧时大鼠心肌细胞系H9C2中HIF-1和CT-1的表达情况，从而为探讨缺血心肌中HIF-1与CT-1的关系提供方法与思路。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM培养基、TRIzol购自Invitrogen公司;CCK-8试剂盒购自广州研创生物技术发展有限公司;HIF-1α抗体，CT-1抗体，actin抗体购自Santa Cruz公司;PCR相关试剂购自博大泰克公司;氯化钴(CoCl2)购于海南青鸟生物科技有限公司;大鼠心肌细胞系H9C2购自上海越研生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与低氧孵育 大鼠心肌细胞系H9C2使用DMEM培养液(加入10%胎牛血清)，放置于37℃、5%CO2孵箱中。低氧环境通过在培养基中加入CoCl2实现。

1.2.3 细胞活性检测 H9C2细胞活性通过CCK-8试剂盒检测。种植于96孔板的细胞，按照每孔100 μL培养基加入10 μL CCK-8溶液的比例进行孵育，2 h后检测OD450。

1.2.4 HIF-1α及 CT-1 mRNA检测 Real-time PCR法检测缺氧前后H9C2细胞中HIF-1α和CT-1的基因水平。CoCl2处理H9C2细胞48 h后提取RNA检测HIF-1α和CT-1的基因表达量。细胞总RNA提取采用TRIzol试剂提取法，具体方法参照说明书。RNA经逆转录反应合成 cDNA，Real-time PCR扩增过程及荧光信号检查、数据的储存和分析均由仪器(ABI Prism 7300 sequence detection system)及自带的SDS软件自动完成。actin作为内对照来评估HIF-1和CT-1 mRNA的表达。

1.2.5 HIF-1α及CT-1蛋白检测 Western blot法检测缺氧前后H9C2细胞中HIF-1α和CT-1的蛋白表达量的变化。CoCl2处理48 h后收集细胞，冷PBS洗涤，加入细胞裂解液各200 μL，经8%SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到硝酸纤维素膜，蛋白封闭液4℃封闭膜过夜;加入鼠抗人HIF-1α单克隆抗体(1∶500)，室温摇床孵育2 h，应用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠多克隆抗体(1∶1 000)室温孵育1 h，再加入化学发光显色剂显色，X光片曝光显影，凝胶成像分析系统扫描。CT-1蛋白水平检测方法同HIF-1。actin作为内对照。

1.3 统计学方法 采用SPSS11.5软件包对实验数据进行统计学处理，配对组间比较采用t检验，以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 使用CoCl2后H9C2细胞的增殖情况 对照组(培养液中无CoCl2)模拟缺氧第1、2、3、4天后的OD值分别为0.220±0.007、0.350±0.055、0.670 ±0.060、0.870±0.053，缺氧组(培养液中加入100 μmol/L的CoCl2)分别为0.220±0.014、0.360± 0.028、0.530±0.047、0.700±0.051。对照组和缺氧组OD值都呈上升趋势，加CoCl2模拟缺氧第1、2天后OD值与对照组无统计学差异(P＞0.05)，加CoCl2第 3、4天后 OD值较对照组降低(P均＜0.05)。

2.2 HIF-1及CT-1 mRNA表达 缺氧组和对照组H9C2细胞中HIF-1α mRNA都有表达(分别为2.90 ×10-3±0.000 5和2.72×10-3±0.000 6)，但缺氧时HIF-1α mRNA较对照组无明显差别(P＞0.05)。CT-1 mRNA在常氧和缺氧条件下也都有表达(分别为3.48×10-4±0.000 08和6.19×10-4±0.000 07)，但缺氧后CT-1 mRNA水平增高(P＜0.05)。

2.3 HIF-1及CT-1蛋白表达 Western blot结果显示，对照组即常氧情况下HIF-1α蛋白几乎没有表达，缺氧后HIF-1α蛋白表达增加(P＜0.05)。CT-1蛋白在常氧和缺氧条件下也都有表达，缺氧后CT-1蛋白水平明显增高(P＜0.05)，见图1。

图1 模拟缺氧后H9C2细胞中HIF-1α及CT-1蛋白表达

3 讨论

在全世界范围内缺血性心脏病的发病率和病死率逐年攀升，尽管目前经皮冠状动脉介入术等治疗已得到广泛应用，部分患者仍无法完全重建血运。研究者们努力寻找新的治疗靶点。心肌缺血会导致心肌缺氧，在体外，缺氧的环境可以通过使用低氧孵箱和使用CoCl2来实现［3］。本研究采用向培养液中加100 μmoL/L CoCl2模拟缺氧。结果显示CoCl2模拟的缺氧环境使心肌细胞系H9C2存活率较常氧时下降。

氧是机体维持生存的必要因素，整体或局部缺氧会引起机体产生一系列适应性反应，这些反应与缺氧诱导产生的HIF-1密切相关，HIF-1作为一种转录因子可调节一系列基因的转录，从而维持机体的功能［4］。HIF-1的 α和 β两个亚单位都属于bHLH-PAS转录因子家族。细胞内氧的水平能够调节α亚单位的稳定性、亚细胞定位和其促转录的功能;而β亚单位在细胞核中持续表达，其活性不受缺氧的影响。α和β亚单位结合后才能发挥促进基因转录的作用。在常氧情况下，α亚单位能通过肿瘤抑制蛋白介导的泛素—蛋白酶途径被迅速降解，而缺氧能阻断这一途径，使HIF-1α单位稳定下来［5，6］。因此，本研究中向培养液中加100 μmol/L CoCl2模拟缺氧后，H9C2细胞中HIF-1α的蛋白水平增加，而HIF-1α的mRNA水平与常氧比较没有变化，这与理论上保持一致。据研究表明，HIF-1在心肌缺血时主要通过促进EPO、VEGF、HO-1、iNOS等基因的表达发挥代偿作用［7］。除此之外，在心肌缺血缺氧时，HIF-1是否还可以通过促进其他与心肌保护密切相关因子的表达发挥代偿作用，值得探讨。

CT-1是1995年Pennica等［8］从小鼠心脏发育的胚胎干细胞中克隆表达出的一种因子，为白细胞介素6细胞因子家族的新成员，因其在体外能够导致心肌细胞肥大而得名［9］。CT-1除可促使心肌细胞肥大外，还有促进心肌细胞存活的作用［10］。近年来，CT-1在心肌受损保护方面的作用受到广泛的关注。CT-1在心肌缺血缺氧情况下表达增加，发挥心肌保护作用，其调控机制是什么，目前尚不明确。有研究表明CT-1在小鼠胚胎细胞中受HIF-1的调控［11］，但在缺氧的心肌细胞中CT-1是否受到HIF-1的调控尚未阐明。本研究结果显示CoCl2模拟缺氧后大鼠心肌细胞系H9C2中CT-1 mRNA和蛋白水平都增加，伴随着HIF-1蛋白水平的增加而增加，提示在缺氧心肌中HIF-1与CT-1可能存在一定的关系。在缺氧心肌中，缺氧会诱导心肌细胞中HIF-1α蛋白增加，HIF-1α和 HIF-1β结合可能通过促进CT-1基因的转录来促进CT-1蛋白的表达。但心肌缺氧时CT-1是否确实受HIF-1的调控，还有待于进一步研究。

本研究为缺氧情况下心肌的代偿机制提供新的见解和实验资料，对揭示缺氧情况下心肌细胞自身调控有重要的生物学意义，对治疗缺血性心脏病提供新的思路和重要的实验佐证。

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