刘 丹，王贵喜，连 瑜，贾 璐，张广炜，宋瑞琪，张 佳，孙 量

(包头医学院第一附属医院，内蒙古包头014010)

在脑卒中发病机制的探讨中，人们已逐渐认识到，遗传因素在其发生、发展中起着非常重要的作用。研究显示，连接蛋白(CX37)基因多态性与动脉粥样硬化形成和进展、急性心肌梗死、冠心病发病密切相关［1～10］，而脑卒中也是在动脉粥样硬化基础上形成和发展的，那么CX37基因多态性与脑卒中是否相关?因此，本研究拟从基因遗传学角度入手，探讨CX37基因I1297D多态性与缺血性脑卒中和出血性脑卒中的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2009年7月～2010年10月在我科连续住院的急性脑卒中患者348例作为脑卒中组，其中男217例、女131例，年龄(61.02± 12.47)岁，其中包括出血性卒中患者116例(脑出血组)和缺血性卒中患者232例(脑缺血组)。依据1990年我国脑血管病分类标准，又将脑缺血组分为脑梗死组115例、脑栓塞组31例、腔隙性脑梗死组(腔梗组)86例，均符合全国第四届脑血管病学术会议通过的诊断标准，并经头颅CT或MRI检查证实。排除标准:严重感染、恶性肿瘤、结缔组织病以及1 a内患组织损伤疾病如心肌梗死，重大外科手术、接受免疫抑制剂治疗者及同时患缺血性脑卒中和出血性脑卒中者。同期选择我院体检中心的无脑卒中病史的体检者235例作为对照组，其中男146例、女89例，年龄(60.86±9.92)岁。两组年龄、性别相匹配，具有可比性。所有入组者知情同意，为包头市长住居民、汉族、彼此无亲缘关系。

1.2 调查和记录方法 详细询问并记录入选者的一般情况(包括姓名、性别、年龄、职业、民族、住院号、地址、联系电话等);既往情况(既往病史及健康状况、吸烟饮酒史);住院情况(包括入院日期、入院NIHSS评分、GCS评分、实验室血液学检验值、头颅影像结果、出院日期、并发症等);随访情况(生存状况、复发、治疗和康复情况以及预后评估量表Barthel Index)。

1.3 限制性片段长度多态性(RFLP)分析技术判定基因型 抽取患者晨空腹静脉血2 mL，置EDTANa2抗凝管中-20℃冰箱保存备用。使用北京天根公司血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA。采用PCR检测，PCR引物序列参照文献设计，由上海生工合成。连接蛋白37基因I1297D基因扩增引物序列为:上游引物5'-GGAGCCTCATTGCAAGTTGT-3'，下游引物5'-TGACTGTTCCATAGGGTGAG-3'，扩增产物为214 bp;反应体系为25 μL，其中模板DNA 100 ng，10×buffer 5 μL，dDNPs 1 μL，TaqDNA聚合酶1.0 U和上下游引物各2 μL;反应条件为:94℃预变性5 min，然后94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，30个循环后，72℃延伸10 min。PCR产物(图1)经HinfⅠ限制性内切酶与37℃消化过夜后，进行3%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后分析基因型。

图1 CX37 I1297D PCR产物电泳图

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料用s表示，用基因计数法计算单个基因型和等位基因频率，不同基因型和等位基因频率比较采用χ2检验，以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 一般资料比较 与对照组比较，脑卒中组患者收缩压、舒张压和甘油三酯水平明显升高(P＜0.05)，有吸烟史比例明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 脑卒中组和对照组一般资料比较

2.2 基因型鉴定 CX37 I1297D的DD型不含酶切位点的AG缺失型酶切产物为214 bp;II型含有酶切位点的AG纯合型，酶切产物为111 bp和103 bp;ID型为杂合型，酶切产物为214 bp、111 bp、103 bp。由于酶切后产生的111 bp合103 bp两条带相距较近，电泳结果显示为一条带(图2)。

图2 PCR-HinfⅠ酶切的CX37 I1297D

2.3 不同脑卒中类型与对照组基因型和等位基因频率比较 脑卒中组和对照组人群CX37 I1297D多态性基因型分布均处于Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05)，具有群体代表性。两组人群CX37 I1297D基因型都出现三种，分别为II、ID、DD型，以II型为主。CX37基因I1297D的基因型和等位基因频率分布在脑出血组、脑缺血组及其各亚组和对照组之间比较，均无统计学差异(P＞0.05)，见表2。

3 讨论

组成缝隙连接的蛋白亚单位称为缝隙连接蛋白，本质为一组蛋白质，现已发现20种以上。通过连接蛋白，相邻细胞间可以形成细胞间通道，即缝隙连接［11］。相邻细胞通过间隙连接进行信息和物质能量的交换，对于细胞的新陈代谢及内环境的稳定等生理过程起着重要调控作用。一些连接蛋白广泛表达于各组织中，而另一些则较为严格地表达于特定组织中，并在那里发挥重要作用。CX37就属于后者，被发现在脉管系统(如内皮细胞、平滑肌细胞)和炎症细胞中(如单核细胞、巨噬细胞)。近年研究发现CX37在动脉粥样硬化的发病机制中具有一定意义;在脑缺血损伤研究中，急性脑缺血后缝隙连接活动增强并参与脑缺血损伤，预先给予连接蛋白阻断剂后，平均梗死面积较对照组明显减少［12］;在蛛网膜下腔出血的模型研究中发现连接蛋白的表达水平上调与脑血管痉挛程度呈正相关［13］。CX37基因位于人类染色体1p35.1，全长2 727 bp，由两个外显子和一个内含子构成，编码333个氨基酸。大量研究发现CX37基因多态性与颈动脉粥样硬化形成、急性心肌梗死、冠心病发病有关。所有这些研究表明连接蛋白参与了多种心脑血管疾病的发生、发展，并在其中起到了重要的作用。但关于CX37基因多态性与脑血管病的研究未见报道。

表2 不同脑卒中类型与对照组CX37 I1297D的基因型和等位基因频率比较［例(%)］

本研究采用RFLP分析技术检测我国北方汉族人群CX37基因I1297D多态的分布并进行分析，结果发现，我国北方汉族人群在该位点存在着AG碱基的插入/缺失多态性，CX37基因I1297D多态性分布以II型为主，DD基因型和D等位基因为少见型。I1297D基因型和等位基因分布频率在脑出血组、脑缺血组和对照组间无统计学差异，而且，在缺血性脑卒中各亚组和对照组间亦无统计学差异，表明中国北方汉族人群的CX37 I1297D位点与脑卒中的发生无明显相关性，提示CX37 I1297D多态性可能不是中国北方汉人群脑卒中发病的易感因素。另外，本研究中脑卒中组有吸烟史者比例及SBP、DBP、TG水平高于对照组，这与关于脑卒中发病机制及危险因素的大部分研究结果相符。

脑梗死发病机制复杂，是获得性危险因素如生活方式、高血脂、高血压、糖尿病等和种族、地域、环境、遗传性危险因素如基因多态性等共同相互作用所致。我们的研究为脑卒中的分子和群体遗传学研究提供了科学的实验依据，为临床防治心脑血管疾病开辟了新的思路。

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