王冬冬，霍乃晨，王晓黎，张淑兰

(1中国医科大学附属盛京医院，沈阳110004;2中国医科大学附属第一医院)

宫颈癌发病率在女性恶性肿瘤中占第2位［1］。常规的治疗方法是手术或者放疗，以及手术和放疗相结合的综合治疗。另外，许多医疗机构将对根治术后患者实行新辅助化疗作为常规治疗［2］。但仍有相当一部分患者存在术后复发和远处转移。因此，寻求手术、放疗、化疗之外的基因靶向治疗和免疫治疗方法是目前探索宫颈癌治疗方法的新方向。IDO是色氨酸经由犬尿氨酸代谢途径中第一步中的限速酶，IDO过度表达可导致色氨酸缺乏和其代谢产物蓄积。色氨酸缺乏可使细胞毒T细胞和NK细胞数量减少［3］，色氨酸代谢产物蓄积可使NK细胞杀伤功能减弱［4］，从而产生肿瘤免疫耐受。肿瘤免疫耐受和宫颈癌的发生发展密切相关。本研究通过IDO基因转染至宫颈癌细胞SiHa，研究IDO在体外对NK细胞的杀伤作用的影响，从而证明了IDO可以作为宫颈癌基因治疗的潜在新靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 宫颈癌细胞株SiHa培养于含10%的小牛血清、100 IU/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中，置于37℃、5%CO2的条件下培养。

1.2 基因转染 用标准的磷酸钙沉淀方法将IDO基因表达载体pcDNA3.1-IDO［5］和空白对照载体pcDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)转染宫颈癌细胞SiHa，经抗生素筛选后得到IDO稳定表达的Si-Ha/IDO细胞株和SiHa/Mock对照细胞株。

1.3 转染细胞的IDO蛋白表达测定 选择耐药克隆株应用Western blot检测IDO和内参β-actin蛋白表达。待3种细胞(SiHa，SiHa/Mock和SiHa/IDO)的细胞汇合度达到95%时，收集细胞，NP-40裂解液裂解后，离心后取上清，检测蛋白浓度(BioRad protein assay kit，Veemendaal，the Netherlands)，聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转至PVDF膜上。1%脱脂奶粉封闭1 h，抗人IDO抗体(TBST溶液1∶1 000稀释)孵育过夜，TBST冲洗3次，二抗(TBST溶液1∶1 000稀释)孵育1 h，TBST冲洗3次后，曝光显影。PVDF膜经蛋白剥离液洗脱后，1%脱脂奶粉封闭，用抗β-actin抗体重复上述步骤。

1.4 细胞生长曲线测定 应用MTT试剂盒，每孔100个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200 μL，将培养板移入CO2孵箱中，在37℃培养，每24 h在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.5 在体外肿瘤细胞对NK细胞杀伤作用敏感性的检测 用MTT试剂盒检测体外肿瘤细胞对NK细胞杀伤作用的敏感性。将3种肿瘤细胞(SiHa、SiHa/Mock和SiHa/IDO)500个分别接种于96孔细胞培养板，同时加入KHYG-1细胞［6］(分别0、500、1 000、2 000个)，在含有10%小牛血清的DMEM/ F12培养基中37℃共同培养72 h。PBS冲洗培养板3次，彻底清除KHYG-1细胞，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，以效应细胞与靶细胞比值(E/T)为横轴，光吸收值为纵轴绘制存活细胞的百分比变化曲线。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，实验结果以s表示，组间比较采用组间Student’s t检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IDO蛋白表达 IDO蛋白在SiHa/IDO细胞中表达阳性，在SiHa和SiHa/Mock细胞中无表达，见图1。

2.2 肿瘤细胞体外生长曲线测定 3组肿瘤细胞(SiHa、SiHa/Mock和SiHa/IDO)在体外生长速度无明显差异(P＞0.05)，见图2。

2.3 体外肿瘤细胞对NK细胞杀伤作用敏感性的检测 见图3。SiHa/IDO细胞存活的百分比高于其他两组对照(SiHa和SiHa/Mock)细胞，P＜0.05。

图3 肿瘤细胞和NK细胞共同培养后存活细胞的百分比变化曲线

3 讨论

IDO是细胞内一种含亚铁血红素的酶，广泛分布于人和其他哺乳动物除肝脏以外的其他组织中，是肝脏以外惟一可催化色氨酸经由犬尿氨酸途径进行分解代谢的限速酶，可以将色氨酸分解为L-犬尿酸、吡啶甲酸和喹啉酸等多种代谢物。正常情况下IDO在体内呈低水平表达。由于色氨酸是细胞维持活化和增殖所必需的氨基酸，同时也是构成蛋白质必不可缺的重要成分，它的存在对各种细胞维持其正常功能非常关键。如果IDO的活性表达异常增高，会导致细胞微环境中色氨酸的耗竭，细胞便会失去正常的功能，生长缓慢甚至凋亡。T细胞和NK细胞对此尤其敏感，因此IDO升高所致的色氨酸缺乏会导致T细胞和NK细胞数量减少［3］，色氨酸代谢产物的蓄积会通过抑制NK细胞受体的作用，从而抑制NK细胞的细胞杀伤作用［4］，由此产生肿瘤的免疫抑制。Uyttenhove等［7］首次报道了IDO在人肿瘤组织中有表达，其中包括:前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌等，妇科肿瘤中，IDO在宫颈癌、卵巢癌和子宫内膜癌组织中均有表达。有研究报道IDO可作为宫颈癌判断预后的指标［8］。

本研究应用IDO基因表达载体pcDNA3.1-IDO稳定转染宫颈癌细胞SiHa，获得了IDO高表达宫颈癌细胞SiHa/IDO。体外细胞增长曲线显示，高表达的IDO对宫颈癌细胞体外生长速度未产生影响。而体外肿瘤细胞对NK细胞杀伤作用敏感性检测结果提示SiHa/IDO细胞对NK细胞杀伤作用的敏感性低于其他两组对照肿瘤细胞(SiHa和 SiHa/ Mock)，证实了IDO升高所致的色氨酸代谢产物的蓄积抑制了NK细胞的杀伤作用。另一方面，血管生成作用也是肿瘤生长和转移的一个重要因素，但目前为止，关于IDO与血管生成作用关系的研究还十分有限。因此，进一步进行体内试验观察IDO对于血管生成，比如说肿瘤内新生血管数量的对比十分必要。

综上，本研究通过体外试验证明了IDO参与了宫颈癌的生长进程，过表达IDO可以抑制NK细胞的杀伤作用，并可以此作为一个理论基础进行进一步的体内试验，研究这一宫颈癌基因治疗的潜在新靶点。

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