张春来，陈晓建，闫晓华，张纪云

(1临沂市红十字会中心血站，山东临沂276000;2山东医学高等专科学校)

特发性血小板减少性紫癜(ITP)是一种获得性自身免疫性疾病，是由抗血小板抗体介导的血小板破坏加速及血小板生成减少的出血性疾病。免疫细胞凋亡是机体免疫调节的重要方式，机体维持免疫系统自稳，避免自身免疫性疾病发生的重要机制。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是一个TNF超家族成员，很多研究发现TRAIL参与免疫细胞对机体的免疫监视，且资料显示TRAIL在促进免疫细胞凋亡，维持自身免疫耐受等方面有一定作用。根据此特性，我们推断其与ITP的发生、发展有关，而国内外对TRAIL基因多态性与ITP的相关性研究还未见报道，我们的研究将填补这个空白，为ITP的发病机制及ITP的预防及治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本研究中ITP患者为2008年10月～2011年12月在临沂市人民医院、临沂市中医院、山东医专附属医院住院及就诊的患者，共132例，其中男40例、女92例，平均年龄36.9岁，诊断标准参照《血液病诊断与疗效标准》第3版［1］。除外其他引起血小板减少的疾病，且各病例间无遗传学关系。同时选择医院健康查体者做为正常对照组，共130例，其中男40例、女90例，平均年龄39岁，所选对象间均无亲缘关系，均山东籍汉族人。

1.2 血液标本的处理和基因组DNA提取 采集两组对象外周静脉血2 mL，EDTA抗凝，采用离心柱法提取基因组DNA(TIANGEN公司)，各取1 μL DNA琼脂糖凝胶(EB)电泳验证DNA提取情况。

1.3 设计引物 根据GenBank中TRAIL基因核苷酸序列，设计引物序列，引物序列如下:上游引物5'-AACATCTTCTGTCTTTATAATC-3'，下游引物 5'-AAATAACACGTACTTACTGAAG-3'。扩增后TRAIL目的基因片段为484 bp。PCR扩增体系:上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板2 μL，双蒸水21 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，总体积50 μL。反应条件:94℃3 min预变性，然后94℃30 s，48℃ 90 s，72℃45 s，共30个循环，最后72℃延伸10 min。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳验证。

1.4 限制性内切酶酶切PCR产物 PCR产物分别使用两种酶酶切，取PCR产物用RsaⅠ酶(Fermentas公司)酶切反应，反应体系:PCR产物10 μL，DD Water 16 μL，10×Buffer B 2 μL，RsaⅠ酶1 μL，37℃水浴2 h。另取PCR产物使用TasⅠ酶(Fermentas公司)酶切反应，反应体系:PCR产物10 μL，DD Water 16 μL，10×Buffer B 2 μL，TasⅠ酶1 μL，65℃水浴3 h，酶切产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳验证。

1.5 PCR产物基因测序 随机取20份PCR产物纯化后测序(上海博亚生物技术有限公司)验证PCR-RFLP法的准确性。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0软件包进行统计学分析，基因频率采用直接计数法，然后确认其是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，各基因频率和等位基因频率比较用χ2检验，以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡定律检验 TRAIL基因1525、1595位点等位基因频率，经χ2检验，ITP组和正常对照组符合Hardy-Weinberg平衡定律，期望值和观察值均无显著差异(P＞0.05)，达到遗传平衡，提示所选两组样本具备群体代表性。

2.2 基因组DNA提取及PCR扩增结果 经琼脂糖凝胶电泳分析，所提取的基因组DNA提取成功，纯度良好，经PCR扩增后TRAIL目的基因片段为484 bp，琼脂糖凝胶电泳，条带整齐且亮，无杂带，说明扩增成功。

2.3 TRAIL基因1525G/A、1595C/T位点基因型分析 PCR产物经内切酶RsaⅠ酶切，TRAIL基因1525位点检测到3种基因型:GG基因型(473 bp、11 bp)、AA基因型(286 bp、187 bp、11 bp)和GA基因型(473 bp、286 bp、187 bp、11 bp)，见图1(虽然11 bp条带不清楚，但并不影响基因型的判断)。PCR产物经内切酶TasⅠ酶切，TRAIL基因1595位点检测到3种基因型:CC基因型(291 bp、193 bp)、TT基因型(291 bp、131 bp、62 bp)和CT基因型(291 bp、193 bp、131 bp、62 bp)见图2。随机抽取20例PCR产物测序，基因型分析与酶切结果完全一致。本试验组 TRAIL基因1525、1595两位点基因型(GG/CC，GA/CT，AA/TT)和等位基因(G/C，/T)频率呈现同样的遗传变化，同前期试验结果一致［2］。

2.4 TRAIL基因1525G/A、1595C/T位点基因型和等位基因频率 TRAIL基因1525、1595位点3种基因型GG/CC、GA/CT、AA/TT在ITP组与正常对照组比较，ITP组1525GG/1595CC基因高于正常对照组，但差异无统计学意义(χ2=2.005，P=0.367); 1525、1595位点等位基因频率在ITP组和正常对照组无统计学差异(χ2=1.260，P=0.262)，见表1。

表1 ITP组与正常对照组TRAIL基因1525、1595位点基因型和等位基因频率分布

3 讨论

ITP是一种自身免疫性疾病，重者可危及生命，其免疫机制是ITP患者体内产生抗血小板膜蛋白的血小板相关抗体，是血小板被网状内皮系统或补体系统过度破坏，而引起血小板减少，出现出血临床表现的疾病。发病机制涉及T细胞、B细胞、细胞因子、细胞受体等多个方面，是多因素共同作用的结果。大量研究表明，ITP的发病主要是在易感基因遗传基础上由至今尚未确定的外因如感染等应激因素而诱发的自体免疫反应所致。

TRAIL生物学功能丰富，能介导病变细胞凋亡，还可诱导各种免疫细胞凋亡，被认为是免疫调节因子，可参与机体的免疫调节、免疫自稳和免疫监视，在自身免疫性疾病的发生中具有重要作用［3］。近几年来TRAIL与免疫性疾病研究较多，如与甲状腺疾病［4，5］，系统性红斑狼疮［6］、类风湿性关节炎［7］等。

目前国内外有关ITP与凋亡因子的研究也有报道，2010年，Yang等［8］研究发现大部分ITP患者巨核细胞数量增加但质量下降，导致血小板数量下降，并且发现ITP患者血清可溶性TRAIL水平下降，提示TRAIL可能与机体免疫耐受有关。2005年，Wang等［9］报道ITP组与正常对照组比较，CD+8T细胞表达FasL和TNF-α明显增高，而ITP组与正常对照组比较TRAIL表达无统计学差异。本次试验结果ITP组TRAIL基因第5外显子3'-UTR区1525/ 1595位点GG/CC基因型频率比正常对照组增高，但是没有统计学差异，可能由于TRAIL在参与ITP疾病发生、发展作用不是很重要，也可能与本试验标本量较少有关，我们将继续收集标本，采用大样本、多地域、多民族广泛协同研究，为ITP的风险估计、预防、诊断及治疗提供路径。

［1］张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准［M］.3版.北京:科学出版社，2007:172-173.

［2］Yan X，Xu L，Qi J，et al.sTRAIL levels and TRAIL gene polymorphisms in Chinese patients with fatty liver disease［J］.Immunogenetics，2009，61(8):551-556.

［3］Leverkus M，Neumann M，Mengling T，et al.Regulation of tumor necrosis factor-related apoptosis-inclucing ligand sensitivity in primary and transformed human keratinocytes［J］.Cancer Res，2000，60 (3):553-559.

［4］Hammound LJ，Lowdell MW，Cerrano PG，et al.Analysis of apoplosis in relation to tissue destruction associated with Hashimoto’s autoimmune thyroiditis［J］.J Pathol，1997，182(2):138-144.

［5］Kandror VI，Krainova SI，KriukovaⅣ，et al.On the mechanisms of thyrocyte proliferation and death in autoimmune thyroid diseases［J］.Vestn Ross Akad Med Nauk，2006，(9-10):56-61.

［6］王丕明，赵培庆，续力云，等.TRAIL基因多态性与系统性红斑狼疮的相关性研究［J］.免疫学杂志，2010，26(9):789-792.

［7］Xie YD，Jin L，Yu QW.The role of IFN-γ，IL-10，IL-12 and TRAIL in sera and synovium fluids from patients with rheumatoid arthritis［J］.Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhil，2007，23(6): 536-537

［8］Yang L，Wang L，Zhao CH，et al.Contributions of TRAIL-mediated megakaryocyte apoptosis to impaired megakaryocyte and platelet production in immune thrombocytopenia［J］.Blood，2010，116 (20):4307-4316.

［9］Wang L，Zhang F，Zhu Y，et al.Mechanism of cell-mediated lysis of autologous platelets in chronic idiopathic thrombocytopenic purpura［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2005，85(43):3048-3051.