李开通，刘达恩，陈小婷，鲁海强，李顺堂

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

当皮肤损伤达到一定深度和范围时，组织自然修复的结局便是瘢痕形成。皮肤创伤愈合过程分为炎症期、增生期、重塑期。在重塑期，填补组织缺损的肉芽组织逐渐发生纤维化，丰富的胶原沉积伴胶原构型紊乱可导致增生性瘢痕形成。胶原本身是一种硬蛋白，无活动能力，占体内蛋白总量的25%，占皮肤干重的70%，是结缔组织的主要成分。胶原的产生是创伤修复过程的高峰，也是瘢痕形成过程的决定性因素。胶原降解主要是胶原酶降解，研究证实增生性瘢痕成纤维细胞胶原酶活性明显低于正常成纤维细胞［1］。胶原酶家族中基质金属蛋白酶-2 (MMP-2，又称明胶酶A)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9，又称明胶酶B)逐渐成为研究热点。本实验主要研究水蛭素对增生性瘢痕组织MMP-2、MMP-9表达的作用及可能机制。

1 资料与方法

1.1 标本来源 临床标本来自2011年4～8月在我院烧伤整形科手术切除的增生性瘢痕组织，其中男7例、女5例。手术室切取增生性瘢痕组织标本均取得患者或家属同意。

1.2 实验材料 胎牛血清(FBS，杭州四季青生物公司);DMEM培养基(Hyclone公司);MMP-2、MMP-9酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海鑫乐生物科技有限公司);水蛭素(武汉圣天宇科技有限公司);倒置相差显微镜(日本Olympus公司);全自动酶标仪(美国伯乐公司)。

1.3 成纤维细胞的培养 成纤维细胞来自增生性瘢痕组织，采用组织块法培养。将临床标本在无菌条件下清洗消毒后切成0.5～1 mm3的组织块，种植于培养瓶内。置于37℃、5%CO2培养箱静置培养2～4 h后轻轻翻转，加入含20%FBS的DMEM培养。每周换液2～3次，待原代细胞长满瓶底70%时消化传代，本实验选用第4～5代细胞。

1.4 实验分组 分为4组:对照组(无水蛭素)，水蛭素0.5 U/mL组，水蛭素1 U/mL组，水蛭素2 U/ mL组。

1.5 水蛭素作用样品提取 选取生长状态良好的细胞消化，不含FBS的DMEM培养液制成密度为2.5×104的单细胞悬液，接种于96孔板。37℃、5%CO2培养箱培养24 h后实验组分别加入0.5、1、2 U/mL的水蛭素药液，对照组加入等量的DMEM培养液。培养观察48 h。收集培养液于无菌EP管中，2 000 r/min离心20 min，去除沉淀取上清液冻存备用。

1.6 ELISA法测定MMP-2、MMP-9的表达 采用双抗体夹心ABC法。将120 μL的原倍标准品进行倍比稀释。标准品孔中加入标准品50 μL、链霉素-HRP 50 μL;空白孔中只加入显色剂A和B及终止液;待测样品孔中加入样品40 μL，HRP标记抗MMP-2、MMP-9抗体10 μL，链霉亲和素-HRP 50 μL。37℃温育60 min。洗涤拍干后加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，震荡混匀，37℃避光反应15 min。每孔加终止液50 μL终止反应。空白孔调零，450 nm波长处测定吸光度值(OD)。绘制标准曲线计算MMP-2、MMP-9表达含量。

1.7 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计分析，实验数据以s表示，组间比较采用t检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 增生性瘢痕成纤维细胞形态学观察 成纤维细胞在培养后第5～7天从组织块爬出，贴壁生长，细胞呈梭形，胞体饱满，细胞排列呈一定弧度。水蛭素作用后细胞开始变圆，细胞间隙增大，数量减少。

2.2 水蛭素对增生性瘢痕成纤维细胞分泌MMP-2、MMP-9的影响 水蛭素能够升高MMP-2、MMP-9的表达，0.5、1、2 U/mL水蛭素组中MMP-2、MMP-9含量均高于对照组，分别以0.5 U/mL组和1 U/mL组作用最明显，但两浓度组间比较差异无统计学意义。见表1。

3 讨论

增生性瘢痕的形成是一个复杂的病理过程，多种细胞因子参与其发生和发展，近年来研究多认为其发生机理是成纤维细胞过度增殖为主的细胞基质降解失衡、过度沉积及细胞因子大量产生［2］，但血管内皮细胞的分化、增殖及新血管的形成等因素都影响着增生性瘢痕的形成［3］。保持基质合成与降解之间的平衡对完成组织修复有重要作用，且细胞外基质蛋白水解是组织修复和重建中的关键过程。而MMPs是细胞基质降解的关键成分，尤其以MMP-2、MMP-9是胶原降解的关键酶［4］。MMP-2、MMP-9分别被称为72 kD-Ⅳ型胶原酶和92 kD-Ⅳ型胶原酶，共同作用底物是Ⅳ型胶原，但MMP-2作用更广泛，还可以降解V、VII型胶原、弹性蛋白、纤维粘连蛋白及蛋白多糖中的蛋白核心。两种MMPs主要由成纤维细胞、角质形成细胞、内皮细胞等合成和分泌，参与成纤维细胞，内皮细胞等的迁移、分化及新生血管形成［5］。Oikarinen采用原位杂交技术发现MMP-9主要表达于表皮细胞中，出现在创面愈合早期，参与创面愈合;MMP-2主要表达成纤维细胞中，出现在创面晚期，参与组织重塑。MMP-2和MMP-9可以分解多种基质，还是肿瘤细胞侵袭性的标志。

表1 水蛭素对增生性瘢痕成纤维细胞MMP-2、MMP-9表达的影响(ng/mL，s)

表1 水蛭素对增生性瘢痕成纤维细胞MMP-2、MMP-9表达的影响(ng/mL，s)

注:与对照组比较，*P＜0.05;与2 U/mL组比较，△P＜0.05

对照组15.179 9±12.863 9 9441.000 0±837.996 3水蛭素0.5 U/mL 55.915 3±12.005 5＊△ 11293.500 0±2593.8550＊△水蛭素1 U/mL 46.365 1±16.083 4＊△ 11709.000 0±461.827 3＊△水蛭素2 U/mL 39.793 7±4.000 3* 10367.000 0±663.429 6*

水蛭是一味传统中药，中医用于治疗血瘀经闭和跌打损伤。水蛭素是医用水蛭中分离纯化的一种多肽，能够与凝血酶活性位点结合，形成非共价复合物发挥抗凝作用，是目前已知的活性最强的凝血酶特异性抑制剂。今年来研究发现水蛭素有抑制增生的作用［6］。张博等［7］发现复方水蛭素对小鼠移植瘤有显著抑制作用;杨影等［8］研究证实水蛭素对体外培养巩膜成纤维细胞及细胞外基质有抑制作用;李璇等［9］发现水蛭素能够抑制成纤维细胞增殖，抑制I、Ⅲ型前胶原mRNA的表达。但关于水蛭素对成纤维细胞分泌MMP-2、MMP-9有何作用的报道较少见。本实验证实，通过体外培养增生性瘢痕成纤维细胞，发现0.5、1、2 U/mL水蛭素能够促进MMP-2、MMP-9的表达，二者表达含量上升，高于对照组。0.5 U/mL水蛭素对MMP-2作用最明显，1 U/mL水蛭素对MMP-9作用最明显。MMP-2、MMP-9是降解瘢痕组织中细胞外基质的主要因素，加入水蛭素后MMP-2、MMP-9的表达含量增加，说明水蛭素能够促进二者基因表达而发挥分解胶原的作用。水蛭素通过促进MMPs表达减轻细胞外基质沉积而减轻瘢痕增生和挛缩，有抑制瘢痕增生的作用。

细胞外基质在创伤修复中具有重要作用，基质代谢平衡失调与增生性瘢痕的形成有紧密关联［10］，MMPs是起主要降解作用的胶原酶。本实验发现水蛭素能够提高MMP-2、MMP-9的表达减轻细胞基质沉积，为进一步研究水蛭素应用治疗增生性瘢痕机制提供了思路。MMP-2和MMP-9与其抑制因子在创面愈合转归中的关系逐渐成为研究热点，水蛭素对其抑制因子的作用需要进一步研究。

［1］Ghahary A，Shen YJ，Nedelec B，et al.Collgenase production is lower in post-burn hypertrophic scar fibroblast than in normal fibroblasts and is reduced by insulin-like-growth factor［J］.J Invest Dermatol，1996，106(3):476-481.

［2］郭丽丽，刘林嶓，陈言汤，等.MMP-1、TIMP-1及PDGF在病理性瘢痕中的表达［J］.中国美容整形外科杂志，2006，17(5): 340-342.

［3］陈伟，付小兵，孙同柱，等.增生性瘢痕组织中转化生长因子-β异构体与受体含量变化及对瘢痕形成的影响［J］.中国修复重建外科杂志，2002，16(4):252-256.

［4］蔡景龙.现代瘢痕学［M］.北京:人民卫生出版社，2008: 143-148.

［5］王志，顾正平，张建忠，等.基质金属蛋白酶-2，9及其抑制因子在增生性瘢痕中的表达特征及意义［J］.武警医学，2008，19 (3):235-239.

［6］Ogiichi T，Hirashima Y，Nakamura S，et al.Tissue factor and cancer procoagulant expressed by glioma cells participate in their thrombinmediated proliferation［J］.Neurooncol，2000，46(1):1-9.

［7］张博，王晓敏，任青华，等.复方水蛭素对小鼠移植瘤组织中p53、Ki-67及VEGF表达的影［J］.山东医药，2008，48(43): 29-30.

［8］杨影，郑燕林，王明芳，等.水蛭素对体外培养的成纤维细胞生长的影响［J］.眼科，2004，13(5):300-302.

［9］李璇，刘达恩，张国佑，等.水蛭素抑制体外模拟增生性瘢痕模型的实验研究［J］.中华中医药杂志，2009，24(7):929-931.

［10］Gailit J，Clark RA.Wound repair in the context of extracellular matrix［J］.Curr Opin Cell Biol，1994，6(5):717-725.