徐 健，项洪刚，易 伟，查思洛

(第二军医大学附属长征医院，上海200003)

反映区域淋巴结侵犯情况的淋巴结转移比率(LNR)是影响大肠癌预后的ⅠA类决定因子［1］，也是判断是否行术后辅助治疗的主要依据。大肠癌淋巴结转移和扩散是一个涉及多因素、多阶段的复杂过程，已有的研究表明基质金属蛋白酶-9［2］(MMP-9)和nm23［3］分别可能具有对肿瘤转移、淋巴结受侵的促进或保护作用。本研究以人结肠癌组织为对象，通过免疫组化染色观察分析nm23和MMP-9的表达，综合分析二者与LNR的关系，以期能更好的评判LNR的风险度。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2007年1月～2011年12月第二军医大学附属长征医院结直肠外科收治并经病理诊断的结肠癌患者567例。患者均为首次接受手术治疗，入选病例至少有1枚淋巴结转移阳性，且送检淋巴结数达12枚以上，剔除术前放化疗病例。其中男366例、女201例，年龄23～92岁、中位年龄62岁。肿瘤分级按WHO分级标准:Ⅰ级(高分化)238例，Ⅱ级(中分化)256例，Ⅲ级(低分化或未分化)73例。送检淋巴结12～48(14.49±8.68)枚。收集患者性别、年龄及其病理资料等。

1.2 组织芯片免疫组化染色

1.2.1 组织芯片的制备 委托上海芯超生物科技有限公司使用组织阵列仪(美国Beecher公司)制作结肠癌组织芯片，操作流程按收集标本、取材、脱水、石蜡包埋、4 μm切片、HE染色标记和芯片制作处理。

1.2.2 免疫组织化学染色采用二步法 鼠抗人单克隆抗体 nm23(No:MAB-0139)和 MMP-9(No: MAB-0245)及二步法免疫组化试剂盒均购自福建迈新生物技术开发有限公司。每次实验均以已知的阳性组织切片作为阳性对照，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，DAB显色。

1.2.3 阳性结果判断 用Mattern积分法［4］染色指数来评定阳性细胞百分率:每例随机观察5个高倍镜视野(×400):无阳性表达细胞为0分;＜50% 为1分;50% ～75%为2分;＞75%为3分。染色强度:0为不着色;1为浅黄色;2为深黄色;3为棕黄色。染色指数为阳性细胞百分率和染色强度之和。阳性表达指数＞3定为免疫组化染色阳性;≤3定为阴性。

1.3 LNR 将LNR(阳性淋巴结数/全部被检淋巴结数 ×100%)分为:LNR0(0)，LNR1(＜10%)，LNR2(10%～25%)，LNR3(＞25%)。

1.4 统计学方法 用SPSS16.0统计软件包进行分析，计数资料组间采用χ2检验，多个变量相关性采用Spearman＇s等级相关分析，以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 结肠癌nm23和MMP-9的表达及其与临床病理特征的关系 结肠癌nm23和MMP-9阳性表达产物呈棕黄色，主要定位于细胞质，呈弥漫分布，见插页Ⅰ图7、8，阳性表达率分别为51.9%和55.0%。两者表达差异与患者的性别、年龄无关(P＞0.05)。但低分化、浸润至浆膜层/淋巴结转移率高和有远处转移的患者，nm23表达阳性率明显较低，而MMP-9表达阳性率则较高。结果表明nm23和MMP-9的表达与肿瘤分级程度、肠壁浸润深度、淋巴结转移率及有无远处转移有关，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.2 nm23和 MMP-9的表达与 LNR的关系

Spearman相关分析显示，LNR和肿瘤原发灶nm23表达呈负相关(r=－0.561，P＜0.05)，LNR与MMP-9表达呈正相关(r=0.569，P＜0.05)。并且nm23和MMP-9的表达呈负相关(r=－0.434，P＜0.05)。

表1 nm23、MMP-9表达和结肠癌临床病理特征的关系

3 讨论

结肠癌术后病理的LNR是判断患者预后的重要独立预后因子，也是确定术后辅助治疗的主要依据［5］。美国癌症联合会和美国病理学家协会建议至少需检出12枚淋巴结以上才能较为准确判断结肠癌的LNR。Wang等［6］的研究发现，LNR是独立的生存影响因子，优于淋巴结阳性数预测预后，更是Ⅲ期结肠癌准确的预后监测指标。但是由于目前病理手段的局限性和存在病理医师个人经验的差异性，我们尚不能做到对所有患者LNR的精确判断，尤其是对于常规HE染色难以发现的淋巴结内单个转移肿瘤细胞或转移肿瘤细胞团直径≤2 mm的微小转移。这就很可能导致对LNR的误判，以至于影响肿瘤分期和后续辅助治疗的决策，因此如何采用其他手段联合病理结果来取得较为精确的LNR，是摆在外科和肿瘤科临床医师面前的一个较为重要的课题。

目前针对nm23基因［7］的研究比较广泛。它包括nm23-H1和nm23-H2。以往的研究表明，它编码的产物对癌细胞运动能力和转移潜能有抑制作用［8］，结肠癌和恶性黑色素瘤等的转移与nm23蛋白表达低下有关，其中的机理可能是通过nm23蛋白产物二磷酸核苷激酶(NDPK)，参与体内高能磷酸键转移，促进细胞分裂，参与G蛋白介导的信号传递，影响细胞内微管的聚合和解聚来影响肿瘤细胞的活性。本研究显示，低分化、浸润至浆膜层、LNR高和有远处转移的患者nm23表达阳性率明显较低，而且nm23的阳性表达率和LNR存在显著的负相关，表明nm23对大肠癌淋巴结转移有明显抑制作用。

MMP-9是MMPs家族中的重要成员，其分子量最大，是Ⅳ型胶原酶，能够降解、破坏细胞外基质中最主要的成分Ⅳ型胶原、Ⅴ型胶原和明胶。大量研究表明，肿瘤转移浸润的潜能与肿瘤细胞产生MMP-9的能力有着密切的正相关关系，对肿瘤的黏附和能动性有影响。在胃癌、结肠癌等恶性肿瘤中均有MMP-9的显著增高。这与本实验研究的结果相一致，低分化、浸润至浆膜层、LNR高和有远处转移的患者中MMP-9表达阳性率明显高于对照组。同样LNR与肿瘤原发灶MMP-9表达呈显著正相关，而且nm23和MMP-9的表达呈负相关。

总之，通过本研究，我们推测大肠癌nm23表达缺失和MMP-9过高表达在淋巴结转移的早期阶段就已发挥作用。因此对于 LNR0的大肠癌患者(Dukes A、B)原发灶中nm23和MMP-9联合检测有望成为评估LNR风险度的有用指标，并对临床制定治疗术后辅助措施和判断预后有重要指导意义。

［1］Edge SB，Compton CC.The American Joint Committee on Cancer: the 7th edition of the AJCC cancer staging manual and the future of TNM［J］.Ann Surg Oncol，2010，17(6):1471-1474.

［2］Arii S，Ishigami S，Mori A，et al.Implication of VEGF and MMPs in hepatic metastasis of human colon cancer［J］.Nihon Geka Gakkai Zasshi，1998，99(7):436-440.

［3］Myeroff LL，Markowitz SD.Increased nm23-H1 and nm23-H2 messenger RNA expression and absence of mutations in colon carcinomas of low and high metastatic potential［J］.J Natl Cancer Inst，1993，85(2):147-152.

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［5］Rosenberg R，Engel J，Bruns C，et al.The prognostic value of lymph node ratio in a population-based collective of colorectal cancer patients［J］.Ann Surg，2010，251(6):1070-1078.

［6］Wang J，Hassett JM，Dayton MT，et al.Lymph node ratio:role in the staging of node-positive colon cancer［J］.Ann Surg Oncol，2008，15(6):1600-1608.

［7］Suzuki E，Ota T，Tsukuda K，et al.nm23-H1 reduces in vitro cell migration and the liver metastatic potential of colon cancer cells by regulating myosin light chain phosphorylation［J］.Int J Cancer，2004，108(2):207-211.

［8］杨俊芬，张蕾，符仲标，等.HSP60和nm23蛋白在结肠癌中的表达及意义［J］.山东医药，2010，50(25):15-17.