孙慧娟，胡纯婷，吴共发

(1中山市阜沙医院，广东中山510632;2南方医科大学基础医学院;3中山大学附属博济医院)

黑色素瘤是皮肤癌中最具侵袭性的肿瘤。虽然近年来检查手段及治疗方法均有进步，但死于黑色素瘤的人数约占所有因皮肤癌死亡人数的70%，且恶性黑色素瘤患者5年生存率只有15%，目前对黑色素瘤的治疗还是缺乏有效的方法。近年来微小RNA(miRNA)在黑色素瘤发生发展过程中的作用越来越被人们重视。2011年11月～2012年4月，我们通过研究miR-205对黑色素瘤细胞生物学行为的影响及可能机制，探讨黑色素瘤的发病机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人类皮肤恶性黑色素瘤细胞系A375购自中国科学院上海生命科学研究院，总RNA提取试剂盒——RNAisoTMPLUS购自日本TaKaRa公司; miRNA qRT-PCR试剂盒购自美国GeneCopoeiaTM公司;miR-205的引物及内参U6的引物由杰特伟公司设计合成;miR-205 mimics及对应的阴性对照由上海吉玛公司设计并合成;胎牛血清及RPMI 1640培养基、阳离子脂质体LipofectamineTM2000及Opti-MEM培养基购自美国Invitrogen公司;Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒购自日本同仁化学有限公司;纤维连接蛋白购自美国Sigma公司;小牛血清白蛋白购自华美生物工程公司;多克隆兔抗人PTEN、p-AKT(ser473)、AKT为美国Bioworld产品;多克隆兔抗人β-actin为美国Santa Cruz Biotechnology产品;抗体稀释液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、ECL反应检测试剂盒、总蛋白提取试剂盒购自碧云天生物技术;蛋白浓度检测试剂盒、胰酶购自南京凯基公司; PVDF膜为美国Millipore产品;辣根酶标记抗兔IgG购自北京中杉金桥公司。各种规格培养板购自美国Corning公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞瞬时转染 待培养瓶中的A375细胞生长状态良好，铺满瓶壁90%时，胰酶消化细胞，吹打，制备成细胞悬液，3.0×105/孔的细胞数铺6孔板，铺板后20 h，细胞生长状态良好，通过瞬时转染上调miR-205表达，转染方法按照说明书进行，转染miR-205 mimics的细胞为实验组，转染 miR-205 mimics negative control的细胞为阴性对照组，另设置不做任何处理的细胞为空白对照组。转染48 h收集细胞RNA检测转染效率及收集蛋白用于Western blot实验。

1.2.2 转染效率检测 细胞总RNA的提取及逆转录反应按照说明书进行，荧光定量PCR反应体系为:2×All-in-OneTMQ-PCR Mix 10 μL，All-in-OneTMmiRNA Q-PCR Primer(2 μmol/L)2 μL，Universal Adaptor PCR Primer(2 μmol/L)2 μL，1ststrand cDNA (diluted 1∶5)2 μL，RNase/DNase free ddH2O 4 μL，终体积20 μL。在PCR反应管中充分混匀反应体系，短暂离心，置入ABI 7500荧光定量PCR仪中进行反应。反应条件为:95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，40个循环，检测荧光信号;溶解曲线分析:95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s，60℃ 15 s。以Folds=2－ΔΔCt表示目的miRNA在实验组与对照组中表达的倍比关系，采用如下计算公式:ΔΔCt=［Ct(miRNA)－Ct (U6)］实验组－［Ct(miRNA)－Ct(U6)］对照组，重复3次实验。阴性对照组为对照组，其余2组与之进行比较，

1.2.3 CCK-8检测细胞增殖变化 细胞0.5×104/孔均匀接种于96孔板，终体积100 μL/孔，每组6个复孔，铺板后20 h转染。转染48 h，每孔加10 μL CCK-8，置37℃，50 mL/L CO2培养箱避光孵育2 h后，用酶联免疫检测仪于450 nm测定吸光度值(OD值)，每组设4个复孔取平均值。

1.2.4 细胞黏附能力检测 将浓度为50 μg/mL的纤维黏连蛋白75 μL加入96孔培养板中，用37℃预热的PBS小心冲洗2次，加入10 g/L缓冲液稀释的小牛血清白蛋白(100 μL/孔)，以封闭非特异性位点。PBS冲洗2次，3组细胞用RPMI 1640培养基制成细胞悬液，浓度均为1×105/mL，以100 μL/孔的量将肿瘤细胞悬液加入96孔培养板中置37℃，50 mL/L CO2培养箱中孵育2 h。培养结束后，倒置显微镜观察，之后缓慢吸出培养液，PBS冲洗未黏附的细胞2次，加入含2%胎牛血清的 RPMI 1640培养基200 μL，每孔加20 μL CCK-8，置37℃，50 mL/L CO2培养箱避光孵育2 h后，用酶联免疫检测仪于450 nm测定OD值，每组设4个复孔取平均值。

1.2.5 细胞划痕实验 预先在6孔板板底作3条标记线，细胞转染18 h后，取出6孔板，用10 μL移液器枪头轻轻地沿直尺垂直于标记线呈“丨”划过板底，PBS清洗细胞2次以洗去漂浮细胞，然后换上2%的胎牛血清培养基，减少细胞增殖对实验结果造成的影响。在划痕后的不同时间点拍照，动态观察3组细胞的迁移情况。

1.2.6 Western blot检测 转染48 h时PBS洗细胞3次，细胞刮刀将细胞刮下离心收集，－80℃冰箱保存备用。按全蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白并测蛋白浓度，每泳道加40 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，湿转将蛋白转至PVDF膜，印迹膜在含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液内室温封闭1 h，加入一抗(PTEN、磷酸化 AKT、AKT、β-actin稀释度分别为1∶500、1∶200、1∶1 000、1∶1 000)4℃过夜孵育，洗膜，加人辣根酶标记抗兔IgG(1∶5 000稀释)，室温孵育1 h，PBST洗膜，ECL化学发光法检测，β-actin为内对照。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，数据用±s表示，转染效率采用两独立样本t检验分析，其余数据采用one-way ANOVA分析，多重比较采用LSD法，方差不齐则采用Dunnett＇s法，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-205上调效率 实验组miR-205表达是阴性对照组的(213.770±12.577)倍，差异具有统计学意义(t=29.301，P=0.000)，阴性对照组和空白对照组间miR-205表达无显著差异(t=－0.804，P=0.506)，说明在A375细胞中成功上调miR-205表达。

2.2 细胞增殖变化 实验组、阴性对照组、空白对照组OD值分别为0.748±0.083、1.241±0.057、1.225±0.054，3组比较差异有统计学意义(F= 139.007，P=0.000)。实验组OD值较阴性对照组及空白对照组均减少(P=0.000，P=0.000)，而后2组差异无统计学意义(P=0.305)。说明上调miR-205的表达能减低A375细胞的增殖能力。

2.3 各组细胞黏附能力的改变 实验组、阴性对照组、空白对照组OD值分别为0.29±0.24、0.58± 0.32、0.59±0.21，3组比较差异有统计学意义(F= 166.349，P=0.000)。结果显示实验组的黏附能力减低(P＜0.05)。

2.4 划痕实验结果 在A375细胞上调miR-205表达后，实验组细胞在36 h和60 h时间点的划痕愈合程度均低于空白对照组和阴性对照组，后两者的划痕愈合程度无显著差别，见插页Ⅰ图6。

2.5 Western blot结果 在A375细胞上调miR-205表达后，PTEN蛋白表达增加，磷酸化AKT蛋白表达减少，但对非磷酸化的AKT蛋白没有影响，空白对照组和阴性对照组各蛋白表达均无差异，见图1。

图1 miR-205对PTEN/AKT通路蛋白影响

3 讨论

黑色素瘤是一种高度恶性肿瘤，常见于皮肤，其进展迅速，极易转移，临床预后极差，严重危害人类健康。黑色素瘤的发生经历一个多步骤的过程，包括从正常色素细胞—色素痣—原位癌—扩大生长—浸润生长。在对黑色素瘤分子形成机制的大量研究中，miRNA起着至关重要的作用。目前关于miRNA在黑色素瘤中的作用相比于其他肿瘤的报道较少，且大部分研究来源于其他肿瘤。miRNA是一类广泛存在于真核生物中，大小约21～25个核苷酸的非编码单链小分子RNA，它通过与靶基因mRNA特异性结合，导致mRNA降解或蛋白质翻译的抑制，从而在转录后水平调控基因的表达，参与生物复杂生命过程的调控。已证实miRNA在肿瘤的发生和发展过程中扮演着重要角色。

miR-205是在多种物种间高度保守的一个miRNA，2007年被证实存在于人类［1］。随后研究证实miR-205在多种肿瘤中起抑癌基因的作用，在多种肿瘤中表达下调，通过恢复其表达后，能抑制肿瘤细胞生长、侵袭和转移［2～4］。在黑色素瘤中，过表达miR-205能抑制黑色素瘤细胞增殖、多克隆形成和动物体内肿瘤形成等，被认为是黑色素瘤的抑癌基因，并且miR-205通过调节AKT磷酸化水平影响细胞增殖能力［5］。在小鼠乳腺上皮细胞中，已证实抑癌基因PTEN是小鼠miR-205的靶基因［6］。PTEN是否为人类miR-205的直接靶基因未见文献报道。我们通过多种生物信息学软件预测发现(http:// www.targetscan.org/，http://www.microrna.org/microrna/home.do，http://cbio.mskcc.org/mirnaviewer/)，PTEN是人miR-205的潜在靶基因。这可能与miR-205在多个物种间具有高度保守性有关。虽然miR-205通过调控AKT通路活性影响黑色素瘤细胞增殖［5］，但黑色素瘤中miR-205与PTEN/AKT通路之间的关系未见报道。

本研究通过在人皮肤黑色素瘤细胞系A375中瞬时转染上调miR-205，观察细胞增殖、黏附、迁移能力的变化及PTEN/AKT通路之间的关系，进一步阐明黑色素瘤的病因机制。研究结果显示，上调miR-205表达后细胞增殖、黏附和迁移能力均显著减低，而Western blot结果显示上调miR-205表达能增加PTEN蛋白表达，减低磷酸化AKT蛋白水平，但对非磷酸化的AKT蛋白表达无影响。PTEN是公认的肿瘤抑制基因，它通过对细胞内蛋白质磷酸化水平的精细调节，影响细胞生长、增殖、分化、凋亡、黏附和迁移等重要生物学行为。大量研究证实PTEN通过干扰一些信号通路能控制肿瘤细胞生长，抑制肿瘤黏附和迁移［7］。PTEN能使PI3K的3-磷酸化位点去磷酸化和负向调节AKT信号通路，使AKT磷酸化水平下降，已知AKT信号通路调节肿瘤细胞存活、增殖和运动能力［8，9］，其磷酸化水平即活性减低能抑制肿瘤细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭转移能力。结合本研究结果，提示在黑色素瘤中，上调miR-205能减弱肿瘤细胞增殖、黏附和迁移能力，这些生物学行为的改变时通过调控增强PTEN蛋白和减低AKT活性水平介导实现的。但由于miRNA具有广泛生物学调控功能，miR-205影响黑色素瘤细胞生物学行为的机制仍然有待进一步研究。

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