王成刚 蒋霆辉 陈越 范济辉 张微微 沈旭波

（1.复旦大学附属中山医院分部放射科，上海 200052；2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院放射介入科，上海 200437）

肿瘤的免疫治疗疗效不理想的一个很重要的原因是与肿瘤细胞相关的免疫耐受和免疫逃逸机制的存在，机体免疫系统无法对肿瘤细胞进行有效的识别和杀伤。吲哚胺2，3－双加氧酶（indoleamine 2，3－dioxygenase，IDO）是人体内肝外色氨酸代谢限速酶，最近研究［1－2］显示多种细胞通过高表达IDO，导致肿瘤局部色氨酸代谢异常及调节性T细胞形成，对T细胞的增殖、分化和活性产生影响，进而介导肿瘤局部的T细胞免疫耐受。本研究通过研究中药复方对Lewis肺癌移植鼠肿瘤微环境中IDO表达的影响，探讨从传统中医药角度开发新型IDO抑制剂的可行性。

1 资料与方法

1.1 实验材料 注射用顺铂（cisplatin，DDP）20 mg／瓶。实验所用中药复方由黄芪、党参、蜂房、仙鹤草、七叶一枝花、山萸肉、山海螺、漏芦等组成，水煎，浓缩至生药含量为2.0g／mL，4℃保存。

1.2 实验动物及分组 近交系C57BL／6纯系小鼠，64只，雌性，体质量16～18g，4～6周龄。将制备好的Lewis肺癌细胞悬液（约含活细胞数1.5×106个／mL，由上海医工院实验动物中心提供）以0.2 mL／只接种于小鼠右腋皮下造模。接种后将小鼠随机分为4组：对照组、化疗组、中药复方组（简称中药组）、中药复方加化疗组（简称综合组），每组16只。接种后第5天开始给药，给药剂量根据人鼠体表面积折合法计算。对照组以0.9%氯化钠液0.4mL灌胃14d；化疗组于给药的第1、第3、第5天，DDP溶液1mL（含DDP 0.1mg）腹腔注射化疗，同时0.9%氯化钠液0.4mL灌胃14d；中药组以中药复方药液0.4mL（含生药0.8g）灌胃14d。综合组的化疗同化疗组，中药复方用法同中药组。各组均每天灌胃1次。将小鼠颈椎脱臼处死，剥离肿瘤组织进行检测。

1.3 观测指标及方法

1.3.1 肿瘤体积变化 自第7天起，每3天用游标卡尺测量每只小鼠腋下肿瘤长径（L）和短径（W），用Steel公式计算肿瘤体积：V＝LW2／2。处死小鼠后称取瘤质量，并观察抑瘤率。抑瘤率（%）＝（空白对照组平均瘤质量－实验组平均瘤质量）／空白对照组平均瘤质量×100%。

1.3.2 EnVision法免疫组化 按常规进行；肿瘤组织IDO蛋白表达水平检测采用western blot方法进行。

1.4 统计学处理 所有数据以均数±标准差（¯x±s）表示。2组间比较用 Mann－Whitney U检验，多重比较校正检验水准为0.05／6＝0.0083。

2 结 果

2.1 各组瘤质量及抑瘤率比较 各组小鼠的成瘤率为100%，各组平均瘤质量分别为：对照组（2.370±1.59）g，化疗组（1.233±0.44）g，中药组（2.211±0.87）g，综合组（0.805±0.49）g。综合组的瘤质量显著低于其余3组（P＜0.01），化疗组与中药组无显差异著（P＞0.05）。抑瘤率依次分别为：中药组31.67%，化疗组64.17%，综合组80.84%。

2.2 治疗后各组IDO免疫组化OD值比较 各组治疗后lweis肺癌细胞中IDO免疫组化OD值分别为：对照组（11.750±0.461），化疗组（10.250±0.194），中药组（10.562±0.182），综合组（9.375±0.202）。4组间比较，差异有统计学意义（H＝24.887，P＜0.001）。

2.3 Westem blot法检测IDO蛋白表达水平 采用Westem blot方法，对小鼠肿瘤组织中IDO蛋白表达水平检测，将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，对照组为1.688，化疗组为1.232，中药组为1.562，综合组为0.949。IDO在对照组中的表达显著高于综合组。

3 讨 论

免疫逃逸是肿瘤细胞的基本特征。肿瘤细胞可表达多种机体免疫系统能够识别并产生特异性免疫应答的肿瘤抗原，同时，各种肿瘤细胞可通过许多途径来逃避机体的免疫监视。导致所谓的肿瘤免疫耐受。研究肿瘤的免疫逃逸机制对于研究肿瘤发生发展原理、提高机体免疫状态、逆转肿瘤的逃逸、设计新的治疗策略具有极大的促进作用。

中医药在这方面显然有着自身的优势。我们的前期研究发现，传承自上一辈中医肿瘤名家的中药经验复方具有调节荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖、降低肿瘤微环境中调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）水平的作用。随着对IDO和Tregs在肿瘤免疫耐受机制中的重要作用及其两者之间相互作用关系的深入研究，众多研究者希望将两者结合应用到抗肿瘤免疫治疗中。

有研究［3］显示IDO在肺癌组织中呈高表达，且与肿瘤转移、进展密切相关，并且化疗对其表达有影响。

目前成功的细胞毒性化疗正面临肿瘤免疫耐受的挑战：一是化疗引起肿瘤细胞死亡释放肿瘤相关抗原，在肿瘤抗原递呈过程中产生免疫耐受；二是化疗会引起阶段性的淋巴细胞减少和稳态的破坏，在此期问T细胞更易发生免疫耐受而不是免疫应答，T细胞的免疫耐受导致肿瘤化疗的失败。本研究显示，中药复方及化疗药物顺铂均可在不同程度上影响Lewis肺癌移植鼠肿瘤组织中IDO表达水平，同时中药复方配合化疗药物顺铂具有协同作用，对于调控肺癌微环境中IDO均显示与单一治疗相比存在一定治疗优势。这为今后从中医药角度研究IDO抑制剂提供了新的思路。

［1］ Prendergast GC.Immune escape as a fundam ental trait of cancer：focus on IDO［J］.Oncogene，2008，27（28）：3889－3900.

［2］ Katz JB，Muller AJ，Prendergast GC.Indoleamine 2，3－di oxygenase in T－cell tolerance and tumoral immune escape［J］.Immunol Rev，2008，222（4）：206－221.

［3］ Sim SH，Ahn YO，Yoon J，et al.Influence of chemotherapy on nitric oxide synthase，indole－amine－2，3－dioxygenase and CD124expression in granulocytes and monocytes of non－small cell lung［J］.Cancer Sci，2012，103（2）：155－160.