李 亮，荣培晶，余玲玲，贲 卉，高昕妍，朱 兵

（中国中医科学院针灸研究所，北京 100700）

明代医家李梴在其著作《医学入门》中写到：“凡药之不及，针之不到，必须灸之。”由此可见，针灸疗法尤其是灸法在中医药学中的地位。但是步入近代以来，随着“重针轻灸”的趋势，灸疗的临床阵地逐渐萎缩，同时灸疗的科学研究滞后也是影响其在全世界推广的重要因素。本项目利用可对分级强度和分级面积刺激发生规律性应答反应的脊髓背角会聚神经元作为研究模型，来探讨病理状态下不同面积和不同强度温度热灸刺激对会聚神经元的量-效激活反应，以期阐明最佳热灸刺激参数以及热灸法作用的神经科学调节机制，进一步提高灸疗疗效，并为其理论的科学化提供一些实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验选用健康成年雄性 SD大鼠，体重220g～300g，由军事医学科学院实验动物中心提供。用10％乌拉坦（urethane，1.0～1.5g/kg体重）腹腔注射麻醉。

1.2 手术准备

首先，动物仰卧位腹腔注射阿托品100μg，行气管插管术，然后移至立体定位仪，并腹腔注射三碘季胺酚，接通呼吸机进行人工呼吸。于背中线切开腰部皮肤，暴露 L1～L3节段脊髓，并用38℃石蜡油覆盖，以免干燥。

1.3 细胞记录

采用充灌 5％NaCl和 Pontamine sky blue溶液的玻璃微电极（阻抗约10～15MΩ），在微电极操纵器控制下根据脊髓背角神经元的坐标定位（脊髓后正中裂旁开 0.5mm～1.5mm，脊髓表面下 500～1500μm）插入电极，寻找所需神经元。细胞放电经微电极引入8301微电极放大器及Power-Lab电生理记录系统，进行细胞放电的放大和信号处理。

1.4 实验程序

在找到放电稳定的神经元后，首先检查神经元对机械刺激（包括触刺激和齿镊夹皮刺激）的反应，观察外周感受野分布范围、感受野大小、量化反应的性质及反应的强度。随后试验这些神经元对CRD刺激（80mmHg）的反应，只有对皮肤和 CRD刺激都发生反应的神经元才列入研究对象。当确定记录到的神经元为我们的研究对象后，首先记录2min的神经元背景活动，然后给予大鼠 50s的 CRD刺激，先观察10s神经元对单纯 CRD刺激的反应，之后在CRD的第10秒开始给予大鼠30s的热灸，观察神经元的同时观察CRD和热灸时的反应变化情况。停止热灸后再观察10s的 CRD反应，停止 CRD后再记录5s的背景活动。此部分实验热灸的施加部位以记录部位对侧非感受野的“承扶”穴（BL36）为中心。为了便于控制刺激参数，我们选用不同温度的热水作为模拟热灸刺激，温度分别为：40℃、42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃，刺激面积分别为：0.785cm2（直 径 Φ1.0cm）、1.766cm2（直 径Φ1.5cm）、3.14cm2（直径 Φ2.0cm）、4.906cm2（直径Φ2.5cm）、7.065cm2（直径 Φ3.0cm）、9.616cm2（直径 Φ3.5cm）、12.56cm2（直径 Φ4.0cm），不同的刺激参数组合共有49种。

内脏伤害性刺激采用直结肠扩张法，将一长约4cm～6cm的气囊经肛门插入直结肠，插入的深度约为5cm。内脏伤害性传入由插入直肠内的气囊充气超过20s～50s造成 CRD，试验的直结肠压力一般控制在80mmHg左右（≥40mmHg为伤害性刺激）。为避免出现过度刺激以及直结肠可能的敏感化，重复 CRD刺激应为间隔5min以上［1］。

1.5 记录部位的组织学检验

单细胞记录结束后，通过玻璃微电极通以20μA的负向直流电 20min～30min，以标记记录位置。留取动物心脏灌流固定，取脊髓组织切片做HE染色观察，参考大鼠脑立体定位图谱（Paxinos＆Watson，2007），确经 Pontamine sky blue标定微电极的记录位置。

1.6 数据采集与分析

Power-Lab计算机数据采集系统及Chart 5.0 for Windows分析软件进行数据整理分析。刺激前、后及差值做描述性统计（Descriptives），表示为 珋x±s。采用配对 t检验，组间差异为有显著性意义（P＜0.05）。实验中实时监控心率和体温。动物体温通过反馈型加热仪控制并维持在36℃ ～38℃之间。

2 结果

2.1 记录到的神经元的一般特性

在脊髓水平的实验中，于43只 SD大鼠的腰1～3节段共记录到137个神经元，其中广动力型神经元（wide dynamic range neuron［2］）115 个，该类神经元为本实验的研究对象，其他类型的神经元22个。本实验记录到的广动力型神经元的Pontamine sky blue标记大部分位于脊髓 Rexed IV和V板层，小部分位于 I，VI板层。L1～3节段脊髓背角 WDR神经元的外周感受野一般位于记录部位同侧，每个神经元的感受范围比较明确，面积从0.2cm2至数平方厘米不等。大多数WDR神经元在实验开始时没有自发的背景活动，偶见单个的或簇状的放电，放电频率很低；但在给予反复的躯体或内脏伤害性刺激后的实验过程中，常出现持续时间较长的放电反应，有的甚至在整个实验过程中都存在。这类神经元对感受野的非伤害弯毛刺激、轻压刺激发生轻微的激活反应，也对各种伤害性强度的机械刺激如夹皮以及内脏扩张等发生明显的激活反应（见图1）。

图1 各种来自躯体和内脏刺激引起的WDR神经元的反应

2.2 CRD对脊髓背角WDR神经元的激活作用

相关文献［1，3］证明，≥40 mmHg 的 CRD 为伤害性的内脏刺激。我们的实验中在10个 WDR神经元观察了80mmHg直结肠扩张（CRD）刺激引起的神经元的反应，神经元从背景活动的4.95±1.86spikes/s增加到 17.67±2.41spikes/s，增加率是背景活动的256.9％±9.12％。如图2显示，80mmHgCRD刺激后与刺激前的空白对照组相比有非常显著的差异（P＜0.001），表明来自同神经节段的内脏伤害性强度的传入能明显激活背角神经元。

图3 当刺激温度为40℃和42℃，刺激面积直径为2.5cm时，体表非感受野热灸对CRD引起的WDR神经元的激活反应的影响示意图

图2 80mmHgCRD对脊髓背角WDR神经元的激活作用

2.3 体表非感受野不同参数热灸对CRD引起脊髓背角WDR神经元激活反应的影响的

在CRD引起脊髓WDR神经元稳定激活的基础上，我们观察了在体表非感受野（以对侧非感受野的“承扶”BL36为中心）施加不同参数的热灸对CRD引起的神经元激活反应的影响。本实验在记录的WDR神经元观察到，非感受野的机械夹皮刺激对神经元的自发性背景放电有较为明显的抑制作用。之后我们在CRD引起脊髓背角 WDR神经元稳定激活的基础上，分别观察了体表非感受野的“承扶穴”（BL36）不同参数的热灸对CRD引起的神经元激活反应的影响。如图3显示，我们的实验结果发现当刺激温度为40℃和42℃时，无论刺激面积多大，热灸对CRD引起的WDR神经元的激活反应都没有产生任何影响。

图4 44℃ ～Φ2.5cm热灸对 CRD引起的WDR神经元的激活反应的影响

图4显示，当刺激温度为 44℃时，大部分面积的热灸刺激对CRD引起的WDR神经元的激活反应都没有产生影响，只是在刺激面积直径为3.5cm时，热灸使得由CRD引起的 WDR神经元的放电反应从热灸前的15.2±2.12spikes/s下降到热灸后时13.51±3.52spikes/s，该热灸组合对 WDR神经元CRD反应的抑制率为22.12±3.42％。这一结果表明，44℃ ～Φ3.5cm组合对 CRD引起的这类神经元的兴奋反应有一定程度的抑制作用，统计学处理结果表明具有显著性差异（P＜0.05）。

图5显示，当刺激温度为 46℃，刺激面积直径为1.0cm和1.5cm时，热灸刺激对CRD引起的WDR神经元的激活作用没有影响。图7的统计图可以看出与对照组相比，46℃ ～Φ1.0cm和 46℃ ～Φ1.5cm组合热灸刺激前后 CRD引起的WDR神经元的激活反应没有差异。

图5 当刺激温度为46℃，刺激面积直径为1.0和1.5cm时，体表非感受野热灸对CRD引起的WDR神经元的激活反应的影响示意图

图7显示，当刺激面积直径为2.0cm时，在记录到的12个神经元观察到CRD所引起的神经元的激活反应从热灸刺激前的14.78±3.32spikes/s下降到热灸时的11.82±2.13spikes/s，抑制率为20％±2.45％。由图 6的统计图可以看出，46℃ ～Φ2.0cm的热灸组合与对照相比有差异（P＜0.05）。图7显示，而当刺激面积直径达到2.5cm时。我们发现在记录到的16个神经元观察到CRD所引起的神经元的激活反应从热灸刺激前的14.63±4.08spikes/s下降到热灸时的 9.12±3.13spikes/s，抑制率为40％ ±3.56％。由图6可以看出，46℃ ～Φ2.5cm的热灸组合与对照相比有显著差异（P＜0.01）。当刺激面积直径为 3.0cm时（图 7），我们发现由CRD引起的神经元激活反应从热灸刺激前的16.34±3.85spikes/s下降到热灸时的9.04±3.96spikes/s，抑制率为 41.32％ ±2.36％。由图 6可以看出，46℃ ～Φ3.0cm的热灸组合与对照相比有显著差异（P＜0.01）。

图6 刺激温度为46℃时，体表非感受野不同面积的热灸对CRD引起的WDR神经元激活反应的影响

图7 当刺激温度为46℃，刺激面积直径为2.0、2.5、3.0、3.5和 4.0cm 时，体表非感受野热

与前2种刺激组合类似，46℃ ～Φ3.5cm热灸组合使得由CRD引起WDR神经元的激活反应从15.95±2.55spikes/s下降到热灸时的8.64±4.86spikes/s，抑制率为 41.34％ ±3.35％。由图 6可以看出，46℃ ～Φ3.5cm的热灸组合与对照相比有显著差异（P＜0.01）。最后，当刺激面积直径为4.0cm时，热灸对 CRD激活反应也存在抑制作用，只是抑制的强度较前3个组合有所减弱，WDR神经元的放电从17.01±1.55spikes/s下降到热灸时的12.24±1.86spikes/s，抑制率为 28.14％ ±4.35％。由图6的统计图可以看出，46℃ ～Φ4.0cm的热灸组合与对照相比有差异（P＜0.05）。

图8 刺激温度为48℃时，体表非感受野不同面积的热灸对CRD引起的WDR神经元激活反应的影响

图9 刺激温度为48℃时，体表非感受野不同面积的热灸对CRD引起的WDR神经元激活反应的影响示意图

结合图8和图 9我们发现，当刺激温度为48℃，刺激面积直径为1.0cm时，热灸刺激对 CRD引起的WDR神经元的激活作用没有影响。当刺激面积直径达到1.5cm时，48℃的热灸刺激开始出现抑制作用。在记录的18个细胞中我们发现，48℃ ～Φ1.5cm热灸组合可以使CRD对 WDR神经元的激活反应从17.89±5.12spikes/s下降到热灸时的12.52±4.86spikes/s，抑制率为 31.15％ ±2.25％。由图8的统计图可以看出，48℃ ～Φ1.5cm的热灸组合与对照相比有明显差异（P＜0.05）。当刺激面积直径为 2.0、2.5、3.0、3.5cm 时，48℃ 的热灸刺激分别使CRD对WDR神经元的激活反应从18.12±3.14spikes/s、16.35 ± 5.17spikes/s、15.46 ±4.31spikes/s、17.86±1.88spikes/s下降为 9.78±1.25spikes/s、7.85 ± 3.69spikes/s、7.68 ±4.12spikes/s、9.1 ± 2.38spikes/s，抑 制 率 分 别 为44.04％ ±1.35％、55±5.31％、53.54±1.56％和51.25％ ±1.56％。图9显示，这4个热灸组合与对照相比均有极显著的差异（P＜0.001），说明在这几种刺激参数下，热灸有非常好的抑制内脏疼痛的作用。而当刺激面积直径为4.0cm时，48℃的热灸对CRD激活反应的抑制作用有轻微的减弱，WDR神经元的放电从19.23±5.31spikes/s下降为11.13±2.31spikes/s，抑制率为 43±3.35％，与对照组相比有显著差异（P＜0.05）。

图10 刺激温度为50℃时，体表非感受野不同面积的热灸对CRD引起的WDR神经元激活反应的影响

图10显示，在观察50℃的热灸对 CRD引起的脊髓背角WDR神经元激活反应的影响实验中，我们发现与48℃相同，当刺激面积直径为1.0cm时，热灸刺激对CRD引起的WDR神经元的激活作用没有影响。当刺激面积直径为1.5cm时，在记录的10个WDR神经元中我们发现，50℃的热灸刺激可以使CRD对WDR神经元的激活反应从14.85±1.18spikes/s下降到热灸时的 9.25±1.86spikes/s，抑制率为40.51％±2.55％，由图10的统计图可以看出50℃ ～Φ1.5cm的热灸组合与对照相比有明显差异（P＜0.01）。当刺激面积直径达到2.0cm～4.0cm之后，我们发现50℃的热灸对CRD的激活反应都有非常明显的抑制作用。50℃ ～Φ2.0cm热灸组合使得CRD诱发的WDR的放电反应从16.56±2.86spikes/s下降到8.35±1.43spikes/s；50℃ ～Φ2.5cm热灸组合使得CRD诱发的WDR的放电反应从 17.54±2.86spikes/s下降到 7.35±3.44spikes/s；50℃ ～Φ3.0cm热灸组合使得 CRD诱发的WDR的放电反应从16.76±1.96spikes/s下降到8.15±2.43spikes/s；50℃ ～Φ3.5cm热灸组合使得CRD诱发的WDR的放电反应从15.86±2.86spikes/s下降到7.15±2.43spikes/s；50℃ ～Φ4.0cm热灸组合使得CRD诱发的WDR的放电反应从 18.52±1.37spikes/s下降到 8.85±4.35spikes/s。图10显示，我们可以看到以上 5个刺激组合与对照组相比均存在非常显著的差异（P＜0.001）。但是我们把 48℃ ～Φ2.0cm、48℃ ～Φ2.5cm、48℃ ～Φ3.0cm、48℃ ～Φ3.5cm 4个组合分别与 50℃ ～Φ2.0cm、50℃ ～Φ2.5cm、50℃ ～Φ3.0cm、50℃ ～Φ3.5cm 相对比发现，50℃ 的热灸对CRD诱发的WDR的放电反应的抑制作用并不比48℃的热灸所产生的抑制作用更强，各组之间相比较均不存在显著差异（P＞0.05）。

继续升高刺激温度，我们在观察52℃的热灸对CRD的这种激活反应的抑制作用是发现，52℃ ～Φ1.0cm组合同样未产生抑制作用。当刺激面积直径为1.5cm时，我们发现 52℃的热灸刺激可以使CRD对WDR神经元的激活反应从16.75±3.18spikes/s下降到热灸时的 9.58±3.21spikes/s，抑制率为39.21％±3.15％。由图11的统计图可以看出，52℃ ～Φ1.5cm的热灸组合与对照相比有明显差异（P＜0.01）。

图11 刺激温度为52℃时，体表非感受野不同面积的热灸对CRD引起的WDR神经元激活反应的影响

当刺激面积直径达到2.0cm～4.0cm之后，我们发现52℃的热灸对CRD的激活反应与50℃的抑制作用类似，都有非常明显的抑制作用。52℃ ～Φ2.0cm热灸组合使得CRD诱发的 WDR的放电反应从 19.56±1.76spikes/s下降到 8.82±3.13spikes/s，抑制率为 44.78±1.35％；52℃ ～Φ2.5cm热灸组合使得CRD诱发的 WDR的放电反应从 14.54±1.66spikes/s下降到7.35±2.53spikes/s，抑制率为 50.21％ ±3.15％；52℃ ～Φ3.0cm热灸组合使得CRD诱发的 WDR的放电反应从13.98±5.46spikes/s下降到7.15±3.53spikes/s，抑制率为 52.78％ ±5.35％；52℃ ～Φ3.5cm热灸组合使得CRD诱发的 WDR的放电反应从 17.84±3.26spikes/s下降到 9.17±3.65spikes/s，抑制率为 47.78％ ±5.35％；52℃ ～Φ4.0cm热灸组合使得CRD诱发的 WDR的放电反应从19.12±3.85spikes/s下降到8.98±2.35spikes/s，抑制率为51.78±5.35％。如图 11显示，我们可以看到以上5个刺激组合与对照组相比均存在非常显著的差异（P＜0.001）。同样，我们把52℃ ～Φ2.0cm、52℃ ～Φ2.5cm、52℃ ～Φ3.0cm、52℃ ～Φ3.5cm 4个组合分别与 50℃ ～Φ2.0cm、50℃ ～Φ2.5cm、50℃ ～Φ3.0cm、50℃ ～Φ3.5cm 相对比发现，52℃的热灸对 CRD诱发的 WDR的放电反应的抑制作用也没有比50℃的热灸所产生的抑制作用更强，各组之间相比较均不存在显著差异（P＞0.05）；而把 48℃ ～Φ2.0cm、48℃ ～Φ2.5cm、48℃ ～Φ3.0cm、48℃ ～Φ3.5cm 4个组合分别与52℃ ～Φ2.0cm、52℃ ～Φ2.5cm、52℃ ～ Φ3.0cm、52℃ ～Φ3.5cm相比较，也发现52℃的热灸对 CRD诱发的WDR的放电反应的抑制作用也没有比48℃的热灸所产生的抑制作用更强，各组之间相比较均不存在显著差异（P＞0.05）。

3 讨论

以往的众多研究已经对针刺作用尤其是针刺镇痛的机制有了较为详尽的阐述，而对于灸法的作用机制以及灸法刺激参数的量化研究相对较少。我们实验室在以往的工作中发现针刺的传入信息可分别经外周A类或C类纤维的传入到达脊髓背角。而伤害性范围的热刺激同样可以激活 Aδ和 C类纤维［4］。另外的工作发现针刺和内脏伤害性传入信号在脊髓水平发生会聚和相互作用，针刺穴位能够抑制内脏伤害性传入所激活的背角神经元反应，且这种作用需要脊髓上中枢参与［5］。提示脊髓水平对躯体和内脏传入信息有会聚和整合作用。

用远高于激活C类纤维的强电流刺激动物脊髓背角和三叉神经尾侧核会聚神经元的感受野，可引起最大的C类纤维的兴奋反应，此时用44～52℃的热水浸烫尾巴或后肢，或用齿镊重夹尾巴、脚爪和口鼻部等伤害性刺激、以及腹腔注射缓激肽作为内脏伤害感受器的强刺激和用电刺激尾巴都能明显抑制会聚神经元对C类纤维传入的反应，最强的刺激可完全阻断C类纤维的传入活动，停止刺激后还有明显后效应。而在尾巴等处用刷毛等非伤害性刺激则不能抑制会聚神经元对C类纤维的传入反应。自然伤害性刺激如辐射热照射、齿镊夹皮激活的会聚神经元反应也可被异位的伤害性机械或热的刺激所抑制。电刺激尾巴引起的大鼠嘶叫阈可被腹腔注射致痛剂苯基苯醌明显升高。这种作用在机体任何一个部位的伤害性刺激都可抑制任何其它区域的伤害性反应的效应被称为“弥漫性伤害抑制性控制”（diffuse noxious inhibitory controls，DNIC）［6～11］。由于DNIC仅影响会聚神经元的活动，因此认为，会聚神经元对正常疼痛的感知是必需的，会聚神经元对伤害性热刺激范围内的微小变化的反应性比高阈值的神经元敏感的多，因此有可能会聚神经元在痛的感觉分辨过程中起的作用更大。

另外，DNIC需要脊髓上中枢调控，在脊髓动物，会聚神经元对外周感受野的刺激反应不受影响。但多种伤害性刺激，如夹皮、热水浸烫尾巴、辐射热刺激、腹腔注射缓激肽或电刺激尾巴等，对 C类纤维的传入反应无明显抑制作用，或只产生很弱（＜30％）的抑制，这种抑制的持续时间一般很短，仅在施加条件刺激的最初10s左右出现。热水浸烫尾巴、用齿镊夹爪对C类纤维传入活动的抑制，也可被在脊髓 C2水平滴注局部麻醉剂利多卡因所阻断［12～14］。

综上所述，“弥漫性伤害抑制性控制”可能是神经系统抗痛效应的机能之一，构成一个脊髓-脊髓上中枢-脊髓的神经回路，整合来自外周的伤害性信号，通过DNIC系统发挥痛的负反馈调节。根据我们的实验结果，体表特定参数的热灸能够很好地抑制内脏伤害性反应，其作用机制很可能就是通过如上所述的DNIC系统。并且只有当温度和面积都达到一定的水平时，热灸的这种抑制作用才最明显，但是舌面积越大、温度越高抑制作用就越好?根据我们的实验结果，刺激温度在 46℃ ～48℃范围内，刺激面积直径在2.0～3.5cm范围内就能够取得良好的治疗效果。

［1］Ness TJ，MA，Gebhart GF. A psychophysiological study in humans using phasic colonic distension as a noxious visceral stimulus［J］. Pain，1990，43：377-386.

［2］Mendell LM. Physiologicalpropertiesofunmyelinated fiber projections to the spinal cord［J］. Exp Neurol，1966，16：316-332.

［3］Pei-Jing Rong，Bing Zhu，Qi-Fu Huang，etc. Acupuncture inhibition on neuronal activity of spinal dorsal horn induced by noxious colorectal distention in rat［J］. World J Gastroenterol，2005，1（7）：1011-1017.

［4］Bing Z，Villanueva L and Le Bars D.Acupuncture and diffuse noxious inhibitory controls：naloxone reversible depression of activities of trigeminal convergent neurons［J］. Neuroscience，1990，37（3）：809-818.

［5］荣培晶，朱 兵，黄启福，等.针刺抑制直结肠伤害性扩张引起的大鼠脊髓背角神经元反应［J］.中国针灸，2005，25（9）：645-650.

［6］Dickenson AH，Le Bars D.and Besson JM.Diffuse noxious inhibitory controls（DNIC）. Effectson trigeminalnucleus caudalis neurones in the rat［J］. Brain Res，1980，200（2）：293-305.

［7］Le Bars D.，Dickenson A.H.and Besson J.M.Diffuse noxious inhibitory controls（DNIC）：I Effects on dorsal horn convergent neurones in the rat［J］. Pain，1979，6（3）：283-304.

［8］Le Bars D.，Dickenson A. H.，and Besson J. M. Diffuse noxious inhibitory controls（DNIC）：II.lack of effect on nonconvergent neurones，supraspinal involvement and theoretical implications［J］. Pain，1979，6（3）：305-327.

［9］Yuka Oono， Keiko Fujii， KatsunoriMotohashi， Masahiro Umino. Di?use noxious inhibitory controls triggered by heterotopic CO2 laser conditioning stimulation decreased the SEP amplitudes induced by electrical tooth stimulation with different intensity at an equally inhibitory rate［J］. Pain，2008，136：356-365.

［10］Ruth Defrin，Irit Tsedek，Inbal Lugasi. etc. The interactions between spatial summation and DNIC：Effect of the distance between two painful stimuli and attentional factors on pain perception［J］. Pain，2010，151：489-495.

［11］Gerrit van Wijk and Dieuwke S. Veldhuijzen. Perspective on Diffuse Noxious Inhibitory Controls as a Model of Endogenous Pain Modulation in Clinical Pain Syndromes［J］. The Journal of Pain，2010，11（5）：408-419.

［12］Bouhassira D，Bing Z，Le Bars D. Effects of lesions of locus coeruleus/subcoeruleus on diffuse noxiousi nhibitory controls in the rat［J］. Brain Res，1992，571（1）：140-144.

［13］Bouhassira D，Bing Z，Le Bars D.Studies of the brain structures involved in diffuse noxious inhibitory controls：the mesencephalon［J］. J Neurophysiol，1990，64（6）：1713-1723.

［14］Bouhassira D，Villanueva L，Bing Z，et al. Involvement of the subnucleusreticularis dorsalis in diffuse noxious inhibitory controls in the rat［J］. Brain Res，1992，595（2）：353-357.

△通讯作者：朱 兵，男，北京市东直门内南小街16号，中国中医科学院理论研究所，Tel：010-64014411。