胡跃强，唐 农，雷龙鸣，祝美珍，毕方方，胡玉英，陈 炜

（1.广西中医学院第一附属医院神经内科，南宁 530023；2.广西中医学院经典中医研究所，

南宁 530001；3.中南大学湘雅医院神经内科，长沙 410008）

脑缺血所造成的神经功能缺失一直为临床治疗的难点，中枢神经系统神经元不可再生的观念被打破后，脑缺血后神经干细胞（NSCs）的移植、分化方面的研究成为当今神经科学领域研究的热点，这也为NSCs移植治疗脑缺血损伤提供了可能。本研究通过观察鼠NSCs移植治疗脑缺血大鼠的效果及清热化瘀方的影响，探讨该方的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与耗材 DMEM/F12干粉培养基、B27、碱性成纤维生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、5-溴脱氧尿苷（BrdU）均为 Sigma公司产品；小鼠抗 BrdU单克隆抗体（Chemicon，USA）及兔抗nestin单克隆抗体（Pharmingen公司）；兔抗神经丝蛋白200（NF200）多克隆抗体（Santa Cruz，USA）；荧光素Cy3标记的兔抗IgG和FITC标记的羊抗IgG（北京中山）。

1.1.2 药物 清热化瘀方由水牛角30g、丹参15g、赤芍 15g、地龙 10g、石菖蒲 10g等中药组成，单味中药浓缩颗粒剂由江苏省江阴市江阴天江药业有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 NSCs的培养 取新生3d SD大鼠，用75％酒精浸泡30min后断头处死取出大脑，分离海马，机械分离组织成单细胞，细胞以105/ml种入平皿，培养基用 DMEM/F12加 B27、bFGF（20ng/ml）和EGF（20ng/ml），2d更换半量培养基，10d左右用机械消化法进行传代。将诱导扩增后的NSCs以105/ml种于0.1％明胶包埋的平皿中，放入含 5％CO2的培养箱中37℃常规培养。

1.2.2 动物分组及处理 SD大鼠100只，重200g～250g，随机分为假手术组（A组）、模型组（B组）、干细胞移植组（C组）、干细胞移植 +清热化瘀组（D组），每组25只大鼠，各组按处死时间分为术后第 2、4、7、14、28天 5个亚组，每个亚组 5只动物。A组：线栓只插入颈内动脉9mm；B组：动物造模后2h灌胃同清热化瘀组等体积的蒸馏水，并给予侧脑室注射等量生理盐水；C组：大鼠在模型制作成功24h后进行 NSCs移植；D组：动物造模后，清热化瘀汤14g/（kg·d）灌胃（按体表面积计算为临床70kg成人剂量的3倍），各组动物均在术前6h灌胃1次，在手术清醒后开始灌胃，每天 1次，每次 1.4m1/100g大鼠，余同 C组。

1.2.3 动物造模 参照 Longa＇s线栓法阻断左侧大脑中动脉（MCAO）制备局灶性脑缺血模型。

1.2.4 NSCs移植 大鼠在脑缺血模型制作成功24h后进行NSCs移植。移植前NSCs经 Brdu（浓度5μmol/l）标记 2d，离心后将其溶解于生理盐水中，细胞浓度调整为 6×105/ml。参照文献方法［1］，将大鼠麻醉、固定，缺血侧侧脑室处（前囟左侧旁1.5mm，前囟后 1.0mm）头皮针垂直进针，在进入5.6 mm后各缓慢推入 10μl细胞悬液，留针 10min后缓慢拔针。

1.3 神经功能缺损评分（NSS）

参照 Chen 等［2］方法，分别于移植后第 2、4、7、14、28天对大鼠进行 NSS，主要观察其运动、感觉功能、平衡能力及生理反射能力；总分为18分，正常为0分，分值越高示其神经损害程度越严重。

1.4 组织处理

将大鼠常规麻醉后，经左心室先后用生理盐水和4％的多聚甲醛进行灌注。然后取脑组织固定、脱水、石蜡包埋，按4μm厚度连续切片。

1.5 神经干细胞增殖检测

采用免疫组化ABC法。石蜡切片以1％H2O2灭活内源性过氧化物酶，滴加正常山羊血清封闭液室温下孵育 30min，接着分别滴加 1∶100稀释的小鼠抗nestin单克隆抗体和兔抗 BrdU单克隆抗体，4℃过夜，然后以 PBS洗涤。再滴加 1∶100的二抗生物素化兔 IgG，PBS冲洗。阴性对照用正常羊血清代替一抗。

1.6 新生神经元检测

采用荧光双标免疫组化法检测BrdU和NF200表达双阳性细胞为新生神经元，小鼠抗 BrdU抗体（1∶100）以 Cy3标记，兔抗 NF200抗体以 FITC标记。被标记新生神经细胞同时发出红色（Cy3）核染区和绿色（FITC）胞浆染色区。

1.7 细胞图像分析

用计算机图像分析系统计数脑梗死后不同时间段阳性细胞数。每个动物随机选取相同位置的6张脑片，每张脑片在大鼠脑缺血半暗带随机选取6个视野（×400），计算每个视野的免疫阳性细胞（BrdU、Nestin、BrdU/NF200）数目的平均值。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠NSS的比较

表1显示，大鼠造模后出现不同程度的神经功能缺损，其症状随缺血时间的延长而逐渐减轻；NSCs组移植后第2、4、7天 NSS与模型组比较差异均无显著性（P＞0.05），但第 14、28天其 NSS均显著低于模型组（P＜0.05）；而 NSCS移植 +清热化瘀组则在第7、14、28天的 NSS显著优于模型组（P＜0.05）。

表1 大鼠 NSS的变化±s）

表1 大鼠 NSS的变化±s）

注：与 B组比较：*P＜0.05

NSS组别2d 4d 7d 14d 28d B组7.8±1.7 7.2±1.6 6.9±1.6 6.6±1.5 6.0±1.2 C组 7.5±1.5 7.0±1.4 6.4±1.2 5.5±1.1* 4.8±1.0*D组 7.3±1.4 6.7±1.3 5.8±1.1* 5.0±1.0* 4.0±0.8*

2.2 大鼠缺血脑损伤后NSCs增殖的比较

模型组大鼠脑缺血损伤后可以检测到少量的nestin阳性细胞，其表达于缺血后7d达高峰（P＜0.05），以后表达逐渐减弱；与模型组相比，NSCs组移植后 nestin表达在第 7、14、28天显著增加；移植加中药组在第14、28天时缺血半暗带区 nestin阳性细胞数较单纯移植组显著增加（P＜0.01，P＜0.05）。模型组大鼠脑缺血损伤后未能检测到 BrdU阳性细胞，NSCs移植后可检测到BrdU阳性细胞，主要分布在缺血周围区，并可见其从室旁区向缺血区移行，其表达于移植后14d达高峰（P＜0.05），以后表达逐渐减弱；移植加中药组在第14、28天时缺血半暗带区BrdU阳性细胞数较单纯移植组显著增加（P ＜0.05）（见表 2、3图① ～ ④）。

表2 各组大鼠 nestin蛋白阳性细胞数比较±s，n=5）

表2 各组大鼠 nestin蛋白阳性细胞数比较±s，n=5）

注：与 B组比较：*P＜0.05，＊＊P＜0.01；与 C 组比较：△P ＜0.05；与组内其他时间点比较：#P＜0.05

组别 时相2d 4d 7d 14d 28d A组00000 B组 4.22±1.46 8.89±1.63 13.78±2.15# 9.20±1.78 7.67±1.60 C组 5.03±1.34 10.65±1.93 20.32±2.45#＊＊15.24±2.21＊＊ 11.56±2.02*D组 6.12±1.27 12.29±1.98 22.25±2.73 18.79±2.67△ 15.25±2.36△

表3 各组大鼠 BrdU阳性细胞数比较±s，n=5）

表3 各组大鼠 BrdU阳性细胞数比较±s，n=5）

注：与 C组比较：△P＜0.05；与组内其他时间点比较：*P＜0.05

组别 时相2d 4d 7d 14d 28d A组00000 B组 0 0 0 0 0 C组 16.23±2.65 25.74±3.21 33.26±4.76* 48.55±6.32* 30.58±5.24 D组 18.36±2.87 29.13±3.36 40.05±5.50 60.49±6.68△ 47.66±5.87△

2.3 新生神经元比较

NSCs移植后 7d可见，少量的 BrdU/NF200双阳性细胞出现在缺血周围处，其表达随缺血时间延长而逐渐增加；移植加中药组在第14、28天时缺血半暗带区BrdU/NF200双阳性细胞数较单纯移植组显著增加（P＜0.05）（见表4和图⑤⑥）。

3 讨论

NSCs是中枢神经系统中具有自我更新能力和多种分化潜能的细胞，虽然终身存在，但由于其绝对数量和局部微环境所限，致使中枢神经系统损伤或变性时，自我修复作用微乎其微。因此，采用外源性干细胞移植成为近年来治疗中枢神经损伤的热点研究领域，也同样为脑缺血损伤的治疗提供了新的思路。

表4 各组大鼠BrdU/NF200阳性细胞数比较± s，n=5）

表4 各组大鼠BrdU/NF200阳性细胞数比较± s，n=5）

注：与 C组比较：*P＜0.05

组别 时相2d 4d 7d 14d 28d B组0 0 0 0 0 C组 0 3.61±0.92 6.73±1.20 19.54±2.24 26.82±3.16 D组 0 5.24±1.08 9.24±1.33 31.60±3.57* 39.75±4.28*

①②:缺血7天C组和D组顶叶皮质nestin蛋白表达(×400);③、④:缺血28天C组和D组顶叶皮质BrdU阳性细胞表达(×400);⑤⑥:缺血14天C组和D组顶叶皮质BrdU/NF200双阳性细胞表达(免疫荧光 ×400)

已有研究证实，NSCs移植能够促进局灶性脑缺血大鼠神经功能的恢复。如Park将NSCs注入缺血鼠脑中，NSCs可接合入变性的 CNS中，可优先移入缺血区，并增殖分化为神经元［3］。Shen等将 NSCs注入鼠脑缺血损伤区，可缩小缺血后脑梗死面积，改善神经功能［4］。最近也有联合移植的相关报道，如Yu等将NSCs和I型胶原联合移植治疗脑缺血，能够显著促进损伤脑组织结构和功能的恢复［5］。中药作为体内微环境的调节剂，可能在减少神经干细胞移植后的副反应，促进其分化和迁移等方面具有重要的作用，国内在这方面也开始了有益的尝试［6］，显示出较大潜力。但联合应用中药复方和NSCs治疗脑缺血的报道甚少，值得进一步探讨。

“毒损脑络”学说是中医中风认识上的新理论，认为中风发病是由于毒邪损伤脑络、络脉破损或络脉拘挛瘀闭、气血渗灌失常所致［7］。结合脑缺血损伤后 NSCs的变化，我们认为脑缺血急性期产生的痰瘀热毒混杂脑内，损伤脑髓及脑络，NSCs的增殖分化迁移之源受到抑制、破坏，导致神经功能缺损及功能恢复受限。因此我们认为，解毒通络是治疗大法［8］，据此理论而设的清热化瘀方，其功能为清热解毒化痰、活血化瘀通络，是治疗脑梗死的有效方剂。一系列研究表明，其通过不同途径对脑缺血损伤组织具有保护作用，作为脑神经功能保护剂在临床运用方面有较好的疗效［9～11］。

本研究发现，大鼠脑缺血损伤可以诱导少量nestin的表达，且在缺血后 7d时表达呈高峰；经BrdU标记的NSCs侧脑室移植后2d即可见BrdU蛋白阳性细胞，主要分布在缺血周围区，并可见其从室旁区向缺血区移行，其表达于移植后14d达到高峰，说明移植的 NSCs能够在宿主脑内存活；免疫荧光显示，NSCs移植后 7d可见 BrdU/NF200双阳性细胞出现在缺血周围处，其表达随缺血时间延长而逐渐增加，说明移植的 NSCs能够分化为新生神经元，也提示移植NSCs对脑缺血大鼠的神经功能恢复起到了积极作用；移植加中药组可显著增加缺血后第14、28天时缺血半暗带区 nestin、BrdU和 BrdU/NF200阳性蛋白表达，说明清热化瘀方可促进 NSCs增殖为神经元并促进其迁移，从而发挥脑保护作用，这为其早期给药治疗提供了实验基础。

［1］彭 岚，张苏明，唐洲平，等.大鼠神经干细胞移植治疗大鼠脑梗死的实验研究［J］.中国现代医学杂志，2004，14（4）：82-84.

［2］Chen J，Sanberg PR，Li Y，et al.Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats［J］.Stroke，2001，32（11）：2682-2688.

［3］Park KI. Transplantation of neural stem cells：cellular＆gene therapy for hypoxic-ischemic brain injury［J］.2000，Yonsei Med J，41（6）：825-835.

［4］Shen CC，Lin CH，Yang YC，et al.Intravenous implanted neural stem cells migrate to injury site，reduce infarct volume，and improve behavior after cerebral ischemia［J］. Curr Neurovasc Res，2010，7（3）：167-179.

［5］Yu H，Cao B，Feng M，et al.Combinated transplantation of neural stem cells and collagen type I promote functional recovery after cerebral ischemia in rats［J］. Anat Rec（Hoboken），2010，293（5）：911-917.

［6］刘柏炎，赖鼎元，谢 勇，等.补阳还五汤对脑缺血大鼠经侧脑室移植神经干细胞存活和分化的影响［J］.中国中西医结合急救杂志，2009，16（1）：22-25.

［7］王立新，蔡业峰，孙景波.从中医学角度认识脑缺血损伤后内源性神经干细胞的增殖分化［J］.南京中医药大学学报，2008，24（4）：221-223.

［8］祝美珍，胡国恒，肖艳芬，等.瘀痰热毒并治抗急性脑缺血损伤的策略探究［J］.时珍国医国药，2009，20（2）：392-393.

［9］胡国恒，龙华君，陈北阳，等.清热化瘀方预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用［J］.湖南中医学院学报，2006，26（2）：7-9.

［10］胡跃强，胡国恒，吴云虎，等.清热化瘀颗粒治疗急性脑梗死临床观察［J］.辽宁中医杂志，2003，20（7）：65-67.

［11］吴云虎，叶 萍，胡跃强.清热化瘀颗粒对局部脑缺血模型海马内 IL-1β及 ICAM-1的影响［J］.现代中西医结合杂志，2004，13（16）：2133-2135.