周小平，马艳红，傅延龄

（1.宁夏医科大学中医学院，银川 750004；2.北京中医药大学，北京 100029）

营卫具有“熏肤、充身、泽毛、温分肉、充皮肤、肥腠理、司开合”的作用，与皮肤生理病理有十分密切的关系。营卫的盛衰是影响皮肤状态的重要因素，因此研究营卫与皮肤衰老间的关系具有理论和实践意义。

1 材料与方法

1.1 动物

健康4月龄昆明种小鼠120只，清洁级，雌雄兼用，购自北京大学医学部实验动物中心。各组小鼠在相同条件下自由摄食、饮水，保持自然光照。

1.2 药物

补益营卫药物由人参、甘草等组成，药物购自本校国医堂，为同仁堂优质饮片。由本校药学系中药制备教研室加工、浓缩成4g/ml（每毫升含4g生药）的浸膏，避光4℃冷藏备用，灌胃时用生理盐水配成所需浓度。设维生素E为阳性对照药，购自市售药店。

1.3 造模及给药方法

1.3.1 分组造模 把120只4月龄昆明种小鼠雌雄分开，每性别小鼠体质量均衡随机各分为6组，每组10只，分别设为正常组、模型组、阳性对照组、补益营卫高剂量组、中剂量组和低剂量组。正常组常规进食饮水及光照。其他各组参照文献法［1］按120mg/kg体质量每日背部皮下注射 D-半乳糖，每周禁食称重1次。

1.3.2 给药 造模同时模型组每日灌服生理盐水，阳性对照组每日灌服维生素 E 50mg/kg，补益营卫高、中、低剂量组按（生药/体质量）8g/kg、4g/kg、2g/kg灌胃，连续 6 周。

1.4 取材方法

第7周处死动物前1d，动物用10％硫化钠溶液脱去两肩胛至两髂骨之间背部皮肤的毛，第2天用10％水合氯醛按3.5ml/kg体质量腹腔注射麻醉，腹主动脉取全血放入肝素钠管中，低温离心机3500rpm，离心20min取上清冷藏待测。分离血清后的红细胞沉淀用0.9％生理盐水3500rpm，离心洗涤2次，－80℃冻存待测。剪下背部脱毛皮肤铺平，用直径1.4cm的打孔器取下两块皮肤，除去皮下组织适当剪碎，先用电动匀浆机匀浆，显微镜下观察，匀浆不充分者再用手动使匀浆充分，浓度为10％，匀浆过程均须在冰水中进行。取材时剪取颈部皮肤，置4％中性多聚甲醛溶液中固定，1周后换溶液1次。24h后常规组织脱水、透明、浸蜡和包埋。

1.5 主要仪器

AE160型电子分析天平，DDL-5型低温离心机，Bio-RAD680酶标比色仪，全自动石蜡切片机，Olympus光学显微镜，台式水浴恒温振荡器SHZ-88等。

1.6 主要试剂

多聚甲醛、无水乙醇等分析纯购自北京化学试剂公司。兔抗鼠 bFGF多克隆抗体、黄色 DAB显色剂、山羊抗兔 IgG-抗体-HRP多聚体、牛血清白蛋白（BSA）均购自北京中山金桥生物工程有限公司。复合消化液购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.7 免疫组织化学法检测bFGF的表达

5μm石蜡切片脱腊、水化，3％H2O2室温孵育10min，PBS洗 3min ×3，去离子水洗 2min，3％H2O2室温孵育 10min，0.01M PBS洗 3次，每次 3min，滴加复合消化酶，37℃ 修复 20min，0.01M PBS洗 3次，每次3min，牛血清白蛋白室温封闭 20min倾弃，滴加 1∶100兔抗鼠 bFGF多克隆抗体，4℃过夜，0.01M PBS洗 3次，每次 5min，滴加山羊抗兔 IgG-抗体-HRP多聚体，37℃30min，0.01M PBS洗 3次，每次5min，滴加黄色 DAB室温显色5min，去离子水洗中止反应，脱水、透明、中性树胶封片。每组染色均设以PBS液代替一抗的阴性对照。必要时去离子水洗中止反应后苏木素衬染，脱水、透明、中性树胶封片。

通过安装在 B×51正置荧光显微镜上的照相系统以及计算机Image-pro plus 5.1图像分析软件对bFGF免疫组织化学显色结果进行拍照和分析。拍照时每剂量组显色组织切片20倍物镜下随机选取18处视野进行拍照存档，测量时用Image-pro plus 5.1图像分析软件以统一的光密度（Density，简称为 D）阈值作为测量指标，以光密度值平均值的高低作为衡量各组皮肤bFGF蛋白表达的尺度。

1.8 数据统计

数据资料均采用均数 ±标准差（珋x±s）表示，数据进行方差齐性检验后用t检验进行多组均数的两两比较。

2 结果

2.1 bFGF蛋白的表达部位

正常小鼠皮肤表达bFGF的阳性细胞主要为表皮细胞、真皮成纤维细胞、毛囊和汗腺上皮细胞、皮脂腺细胞和血管内皮细胞。在表皮细胞、毛囊和汗腺上皮细胞胞浆、皮脂腺细胞胞核强表达；成纤维细胞表达较弱，表现为棕黄色颗粒（见图1A）。造模后，bFGF在上述部位表达均减弱，表现为淡黄色显色（见图1B）。给与维生素 E及补益营卫处理后，上述部位bFGF表达明显增强，表现为棕褐色显色颗粒（见图1C、D、E、F）。阴性对照所有皮肤结构均未见阳性显色。

2.2 免疫组织化学方法分析bFGF蛋白在各组小鼠皮肤的表达

表1显示，造模后bFGF表达水平显著降低，与正常组相比有统计学意义（P＜0.05）。补益营卫处理后，高剂量组 bFGF水平显著增加，与正常组，模型组、VE组、低剂量组相比均有显著性差异，分别为 P＜0.05，P ＜0.001，P ＜0.05和，P ＜0.05。中、低剂量组、VE组均使下降的 bFGF基本恢复至正常水平，高剂量组蛋白含量与阳性相比增加，有统计学差异（P＜0.05）。

表1 补益营卫对小鼠皮肤bFGF蛋白表达的影响

3 讨论

《伤寒论·平脉法》58条中说：“寸口脉缓而迟，缓则阳气长，其色鲜，其颜光，其声商，毛发长；迟则阴气盛，骨髓生，血满，肌肉紧薄鲜硬。阴阳相抱，荣卫俱行，刚柔相得，名曰强也。”在第69条说：“寸口脉微而涩，微者卫气衰，涩者荣气不足，卫气衰，面色黄，荣气不足，面色青。荣为根，卫为叶，荣卫俱微，则根叶枯槁……”指出营卫充盛，则肌肉健壮，容光焕发，没有衰老之象；反之，营卫不足，则面色青黄，衰象显露。碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factors，bFGF）是一种多功能的细胞因子，具有多种生物活性，可诱导大多数来自中胚层和神经外胚层细胞的有丝分裂，在胚胎形成、血管新生、神经营养和创伤愈合中起重要作用［2］，也与创面愈合和组织修复密切相关［3、4］。bFGF常通过旁分泌或自分泌机制在皮肤组织中发挥重要生理功能。研究结果表明，bFGF及其受体在胎儿和成人皮肤组织中都有阳性表达，且它们的表达量随着皮肤组织的不断成熟而逐渐增大，表明皮肤的生长发育、表型和功能的维持以及损伤后的修复可能都需要bFGF参与，并且内源性 bFGF可能是皮肤修复与再生的重要内源性调控因子［5］。bFGF的这些功能与营卫“充皮肤，肥腠理”的功能之间存在共性。衰老时皮肤胶原合成减少，弹性降低，血管生成减少，密度降低，可能与bFGF之间存在内在联系，也与营卫之间存在内在关联。

图1 小鼠皮肤组织bFGF免疫组化显色（DAB 10×20）

我们在先前的研究中发现，补益营卫能够增加衰老皮肤中减少的胶原水平。本试验进一步的机制研究中发现，在小鼠皮肤衰老模型中 bFGF表达减少，与正常小鼠皮肤相比有显著差异，提示 bFGF表达减少与衰老皮肤胶原减少有内在联系。补益营卫处理后，bFGF的表达增加，尤其是高剂量组，与其他组包括阳性对照组维生素E组相比都有显著差异，说明补益营卫处理增加胶原合成的一个重要途径是通过bFGF实现的，也是补益营卫延缓皮肤衰老的重要原因之一。

［1］HalliwellB，Gutteridge JMC.Free radieals in biology and medicine［M］.3rded，Newyork：Oxford University Press，1999.617.

［2］Aigner A，Ray PE，Czubayko F，etal.Immunolocalization of an FGF-binding protein rev-eals a widespread expression pattern during different stages of mouse embryo devel-opment［J］.Histochem Cell Biol，2002，117（1）：1-11.

［3］Nakada T，Saito Y，Chikenji M，etal.Therapeutic outcome of hyperbaric oxygen and basic fibroblast growth factor on intractable skin ulcer in legs：preliminary report［J］. Plast Rec-onstr Surg，2006，117（2）：646-651.

［4］Akita S，Akino K，Imaizumi T，Hirano A.A basic fibroblast growth factor improved the quality of skin grafting in burn patients［J］.Burns，2005，31（7）：855-858.

［5］陈 伟，付小兵，孙同柱，等.碱性成纤维生长因子及其受体在胎儿和成人皮肤内的表达特征及其意义［J］.中国危重病急救医学，2002，14（7）：400-403.