谭 勇，李 健，吕 诚，肖 诚，许少华，杨 静，赵宏艳，鞠大宏，吕爱平△

（1.中国中医科学院中医临床基础医学研究所，北京 100700；2.北京中医药大学基础医学院人体形态系，北京 100029；3.卫生部中日友好医院科研处，北京 100029；

4.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700）

既往的研究表明，氢化可的松肾阳虚证模型能够较好地模拟临床肾阳虚证状态［1］；白附片可导致健康大鼠和肾阳虚模型大鼠血清和心脏组织中酶学的异常改变，随着白附片使用的增加，异常程度加重，且与健康大鼠相比，肾阳虚模型大鼠酶学异常改变程度较轻［2-3］。为进一步探索白附片醇提物对健康大鼠和肾阳虚模型大鼠的心脏毒性差异，本研究通过心电图和心脏组织病理观察白附片的心脏毒性，从而为基于中医对证动物模型评价中药毒性的合理性提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选用SPF级雄性SD大鼠80只，体质量180g～200g，由军事医学科学院提供（合格证号 SCXK-（军）2007-004）。

1.1.2 药物 造模用药注射用氢化可的松琥珀酸钠（天津生物化学制药有限公司，生产批号20080604），用生理盐水配成浓度为 71.43mg/ml的溶液；灌胃给药：白附片（北京燕京饮片厂，生产批号081117，产地四川）用乙醇提取制成 2g生药/ml的溶液（由中国中医科学院中医基础理论研究所方证研究中心提取）。

1.1.3 仪器 MP-100型生理实验信号采集分析系统（美国 BloAP公司），光学显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立和分组 80只大鼠适应性喂养7d后随机分为2组（健康组和模型组）各40只。模型组和健康组中的每只动物每天上午在臀部肌肉丰厚处各自注射0.5ml/kg的氢化可的松琥珀酸钠溶液和生理盐水溶液，连续 9d。然后，再把2组动物分别随机分为低剂量、小剂量、中剂量和大剂量4个给药组和空白对照组，每组8只。

1.2.2 给药方法 分组当天对给药组和空白对照组大鼠分别灌胃给予10ml/kg的白附片溶液和生理盐水，每天1次，连续14d。给药组给药浓度从低到高依次为：0.32g/kg、0.64g/kg、1.28 g/kg 和 2.56 g/kg。

1.2.3 取材 给药结束后，所有大鼠称重并于麻醉状态下采用颈椎脱臼法处死，迅速取出完整心脏称取湿重，然后切取部分心脏组织浸入4％的甲醛溶液固定。

1.2.4 心电图检测 在大鼠给药的第12天以腹腔注射3％戊巴比妥钠0.10 ml/100g质量麻醉大鼠后，使其平躺俯卧于平板上，以 Biopac MP多道生理记录仪描记Ⅱ导联心电图，记录心率（BPM）和峰-峰值（P-P）以及心律失常情况。

1.2.5 组织病理学观察 固定后的心脏组织行常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片及 HE染色，光镜观察并摄片。

1.3 统计学处理

剂量资料，组内各剂量处理组间比较采用单因素方差分析，组间采用广义线性模型两因素方差分析；计数资料用卡方检验精确概率法和Logistic回归分析，显著性水平取 P＜0.05。

2 结果

2.1 造模及白附片给药对大鼠行为形态的影响

造模致使大鼠精神萎靡、眯眼、嗜睡，蜷缩、扎堆，对声音、触动刺激反应迟钝，以及出现毛耸而脏、失去光泽的表现。给药致使大鼠不安走动，易激惹，双目、口唇红赤，饮食减少，呼吸急促，模型大鼠的反应较轻。

2.2 白附片对 BPM和 P-P的影响

表1显示，健康组和肾阳虚证组各组内比较，2组 BPM在给药剂量为0.64 g/kg时，与各自空白组比较，BPM增大，有显著性差异（P＜0.05），并随着剂量的加大，BPM增大的趋势更明显，有非常显著性差异（P＜0.01）；2组 P-P在给药剂量为 0.32 g/kg时，与各自空白组比较，P-P增大，有显著性差异（P＜0.05），亦随着剂量的加大，P-P增大的趋势更明显，也有非常显著性差异（P＜0.01）。健康组与肾阳虚证组组间比较，BPM和 P-P随着剂量变化在2组间无统计学差异，但与肾阳虚组 BPM比较，健康组BPM随着剂量增加而增大的幅度更大。

表1 不同剂量白附片对健康和肾阳虚大鼠BPM和P-P的影响比较±sd）

表1 不同剂量白附片对健康和肾阳虚大鼠BPM和P-P的影响比较±sd）

注：各组内比较，与健康空白组比较：*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；与肾阳虚证空白组比较：▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

检测指标 组 别白附片剂量（g/kg）统计结果0 0.32 0.64 1.28 2.56 检验参数F P BPM（B） 健康组 379.50 ±36.71 406.00 ±38.24 423.63 ±17.70*436.13 ±19.93＊＊453.88 ±20.39＊＊ 模型检验19.78 0主效应：剂量 54.23 0模型组 387.63 ±10.88 403.14 ±20.28 417.57 ±18.72▲ 424.57 ±14.47▲ 433.25 ±13.13▲▲ 主效应：组别 0.15 0.698交互效应 3.15 0.080 P-P（V） 健康组 0.34 ±0.14 0.49 ±0.09* 0.68 ±0.16* 1.21 ±0.69＊＊ 1.29 ±0.42＊＊ 广义线性模型19.81 0主效应：剂量 58.80 0模型组 0.32±0.14 0.55±0.27▲ 0.99±0.59▲▲ 0.85±0.29▲▲ 1.58±0.65▲▲ 主效应：组别 0.02 0.897交互效应0.38 0.541

2.3 白附片对心律的影响

图2显示，白附片对大鼠心律有显著影响，其影响主要表现为室性早搏、心动过速等（Ⅱ导联记录时间间隔4 s）。表2显示，对2组各剂量心律失常数量进行比较，结果显示，不同剂量给药对心律影响不同，剂量越大，心率失常发生率越高；2组间心律失常发生率比较无统计学差异，但与肾阳虚大鼠比较，健康组大鼠心律失常发生率随着剂量增加而增大的幅度更大。

2.4 白附片对心脏组织形态的影响

图4显示，正常心肌着色均匀，肌纤维粗细大小较一致，肌核清晰可见，肌膜及间质细胞数量未见增多，心肌肌浆内未见有粉染粗大颗粒、肌浆凝聚或肌浆溶解，间质内也未见炎细胞浸润及瘢痕组织形成，间质血管走行及形态结构均正常。给药剂量为0.32 g/kg时，2组心脏组织无病理形态学改变；给药剂量为0.64 g/kg时，健康组心肌着色不均，可见心肌血管扩张充血，模型组心肌纤维波浪样走行，偶见有空泡样变性；给药剂量为 1.28g/kg时，健康组心肌着色不均，有处可见心肌纤维波浪样走行及心肌纤维消失，其内伴有淋巴细胞浸润，模型组心肌间隔增宽、水肿、血管扩张充血；给药剂量为2.56 g/kg时，健康组心肌着色不均，伴有肌浆溶解、血管扩张充血、心肌间隔增宽、水肿，伴有散在的淋巴细胞浸润，有处可见灶状心肌出血、肌纤维消失，其内伴有单核、中性粒细胞浸润，模型组心肌着色不均，血管扩张充血，有处可见灶状心肌出血。

表2 不同剂量白附片引起健康和肾阳虚大鼠心率失常情况比较

图4 大鼠心脏组织形态学改变

3 讨论

治疗作用与不良反应是药物本身所固有的两重性作用，强烈的不良反应表现为药物的毒性。产生毒性的原因是药物选择性作用差、作用所涉及的范围广泛。当其某一效应被用作治疗目的时，其他效应就有可能成为毒性作用。机体的生理病理状况、性别、年龄、遗传因素、用药剂量、用药时间、药物相互作用、环境因素以及机体的自身内环境的稳定情况均可影响药物毒性反应的发生［4］。因此，临床治疗疾病必须充分考虑用药的安全性和有效性，根据治疗需要权衡利弊，决定取舍，才能有效地避免药物的毒性反应。

中医有“有故无殒”的临床用药理论。这个理论阐述的实质是：只要针对适应证，药物的不良反应甚或毒性反应会降低。“针对适应证”，对中医而言就是对证，药证相应是避免中药毒性反应的必要条件。而目前多采用健康动物评价中药的毒性，这与中医临床实践不相符。因此，所得的评价结果不足以充分、合理地说明中药的毒性。鉴于此，我们提出“在对证状态下评价中药毒性”的假说。药物的毒性评价主要包括临床前和临床中两方面的评价，其中临床前评价是前提和基础。临床前评价是主要基于各种动物体内实验探索药物的毒性以及毒性机理的过程。因此，我们首先通过动物实验来印证假说。

白附片为毛茛科多年生草本植物乌头的子根加工品。其性刚烈迅捷，走而不守，通上达下，行表彻里，有上助心阳、中温脾阳、下补肾阳之殊功，被誉为“回阳救逆第一品药”。虽然白附片有独特、迅捷的疗效，但强烈的毒性反应限制它在临床上的广泛应用。现代研究表明，白附片中的双酯二萜生物碱具有心脏毒性，心律失常是最典型的表现，以频发室早最常见，且为多源性，并易形成二联律及阵发性室速、扭转型室速，甚至发展为室颤［5］。毒性病理学评价是药物临床前毒性评价中最基本的环节，观察病理形态学改变是评价毒性的金指标［6］。既往有研究表明，白附片可导致心肌细胞凋亡，使心肌细胞肌原纤维溶解、断裂，线粒体增生，肌质网扩张，闰盘扭曲，膜断裂［7、8］。鉴于白附片具有明确疗效和典型毒性反应以及现代研究基础，我们选择白附片作为研究对象，重点研究心脏毒性，把观察心律失常情况和心脏组织病理形态学改变作为观测的重点，探索其对健康和肾阳虚对证模型大鼠心脏毒性差异，以印证假说。

本研究结果表明，白附片导致健康和模型大鼠BPM和P-P增大以及心律失常，这与白附片使迷走神经兴奋、心肌细胞钠钙通道障碍、心脏电位紊乱等有关［9-11］。随着白附片剂量的增加，健康和模型大鼠BPM、P-P和心律失常的程度加重，显示出显著的剂量依赖性。虽然2组之间没有统计学差异，但是与模型大鼠比较，却表现出健康大鼠心电图异常程度更重的趋势。若下一步研究加大样本量，可能出现2组之间的统计学差异。心脏组织形态学观察发现，白附片致使健康和模型大鼠心脏病理损伤也存在剂量依赖性，病损程度随着剂量的增加而加重，且同一给药剂量时，2种大鼠心脏病理改变存在明显的差异，模型大鼠病理改变相对较轻。总之，以上结果为“白附片对肾阳虚证大鼠的心脏毒性低于健康大鼠的心脏毒性”假设提供了一定的动物实验依据。

结合我们以往的研究结果可以推论，针对对证动物模型，有毒中药的毒性反应相对较小。这不仅证明证候作为一种机体状态，是影响药物是否产生毒性的重要因素，而且说明在对证状态下才能全面、准确地评价中药的毒性。既往的研究发现了“基于中医证候理论评价中药毒性”的合理性，但这仅仅说明了一种客观存在的现象，其科学基础何在，有待进一步深入探讨。中药具有多成分、多方向和作用多靶点的特点［12］，证候呈现动态、多维的网络关系［13］，因此在对证状态下评价中药的毒性机制，必然要采用系统、网络化的方法。现代系统生物学的发展为中药毒性的深入研究提供了新技术和新方法，采用组学、生物信息学、网络信息学、数据挖掘等新兴的交叉学科技术，发掘、优化和完善评价方法，全方位探索中药的毒性及其内在机制，不仅将推动中医药的现代化，也将为现代药物研究提供新思路。

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△同等贡献作者