王政润，于建霖，孔庆霞

小球藻细胞匀浆制备方法探究

王政润，于建霖，孔庆霞通信作者

（天津农学院 水产学院，天津 300392）

以普通小球藻为受试生物，研究了液氮匀浆法、研磨匀浆法、机械匀浆法、反复冻融法等4种匀浆方法的破壁效率，同时使用4种方法制备的匀浆液测定SOD活力和GSH含量，旨在筛选出破碎效率高、方便快捷且测定生理生化指标准确的方法。试验结果表明，4种方法的破碎率分别为81.43%、100.00%、92.41%、56.54%，SOD活力分别为47.06、48.58、0、25.05 U/mgprot，其中研磨匀浆法与液氮破碎法的测定结果无显著差异（＞0.05）；GSH含量分别为34.42、24.52、87.37、38.75 mgGSH/gprot，研磨匀浆法、液氮破碎法、反复冻融法的测定结果无显著差异（＞0.05），与机械匀浆法差异显著（＜0.05）。结果说明，研磨匀浆法和液氮破碎法的破碎率高，生化指标测定准确。但由于研磨匀浆法耗费人工成本过高，且无法处理大量样本，相较而言，在上述方法中采用液氮破碎法是制备小球藻细胞匀浆液最好的方法。

普通小球藻；匀浆方法；细胞破碎率；生化指标

小球藻（）属于绿藻门、绿球藻目、小球藻科，其中常见的有蛋白核小球藻（）、普通小球藻（）、海水小球藻（）等。在水生生态毒理研究中，单细胞绿藻可以直接观察细胞水平上的中毒症状，是较为理想的试验材料，常用作急性毒性测定。小球藻是应用最多的藻类之一，也是国家环保局推荐使用的藻类毒性测试的试验藻之一[1-3]。

通常，所有的毒性效应都是开始于毒物与生物分子的相互作用，在生化水平上生物标记物可以用来指示毒物造成的效应，最主要的生物标记物是各种酶[4]。酶一般是大分子物质，不会经由细胞膜转运出细胞，需破碎细胞，将酶释放从而测定酶的含量或活力。然而小球藻不同于其他动植物，其具有较厚、坚硬且成分复杂的细胞壁[5-7]，保护细胞膜不易被破坏，加大了细胞破碎和匀浆的难度，影响生化指标测定的准确性。实验室通常采取物理匀浆方法，如液氮匀浆法、研磨匀浆法、机械匀浆法、反复冻融法[8]等。同时，几种物理匀浆方法之间也存在操作便捷性和生化指标测定准确性的差异，因此，亟待在现有方法中筛选一种高效、经济的小球藻匀浆液制备方法。

本文以普通小球藻为试验对象，分别对几种物理匀浆方法进行比较，并通过比较超氧化物歧化酶（SOD）和还原型谷胱甘肽（GSH）的测定结果，筛选出1种最为合适的小球藻匀浆液制备方法。

1 材料与方法

1.1 材料

普通小球藻（）取自天津农学院海洋渔业资源实验室，使用f/2培养基培养。培养基在使用前用高压灭菌器（HVE50，平山制作所株式会社）121℃灭菌20 min。小球藻置入光照培养箱中培养，培养箱内光暗比14 h∶10 h，温度（24±1）℃，相对湿度38%，光照强度50 μmol/（m2·s）。取20 mL藻液，因匀浆方法差异，经0.45 µm微孔滤膜抽滤，取截留藻细胞的滤膜，或4 000 r/min离心10 min，弃上清取沉淀的藻细胞。

1.2 方法

1.2.1 细胞匀浆

藻细胞匀浆液按照以下操作制备。

1.2.1.1液氮匀浆法

将含有藻细胞的滤膜置于研钵中，加入20 mL液氮，用捣杵将滤膜碾成粉末状，加入2 mL生理盐水。

1.2.1.2 研磨匀浆法

将2 mL生理盐水加入离心收集的藻细胞中，置于研钵中，加入1 g石英砂，冰水浴条件下研磨30 min。

1.2.1.3 机械匀浆法

将2 mL生理盐水加入离心收集的藻细胞中，加入20颗直径为2 mm的钢珠，用高通量组织研磨仪（宁波新艺超声设备有限公司）处理3 min，频率68 000 Hz。

1.2.1.4 反复冻融法

将2 mL生理盐水加入离心收集的藻细胞中，置于-20 ℃冰箱冷冻；待完全冻结后取出解冻，解冻一半时用涡旋混合器震荡，融化后重复冷冻操作，共计3次。

1.2.2 细胞破碎率的测定

取200 µL匀浆液注入血球计数板的计数池中，盖上盖玻片，在生物显微镜（BX53，OLYMPUS）下观察计数，统计完整细胞数。每种匀浆液重复计数3次。

1.2.3 生化指标的测定

将制备的匀浆液2 500 r/min 离心10 min，取上清液用于测定生化指标。

通过黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力。藻细胞内产生的ROS氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，在550 nm处测定其吸光度。超氧化物歧化酶活力指的是每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。

通过分光光度法测定GSH含量。含巯基的化合物与5，5＇-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（TDNB）在pH＝7时反应生成黄色的2-硝基-5-巯基苯甲酸，其颜色深浅与GSH的浓度成线性关系，在412 nm处具有最大吸收。细胞内GSH含量指的是毫克谷胱甘肽每克蛋白（mgGSH/gprot）。

1.3 数据处理

采用SPSS 20.0进行数据处理及单因素方差分析，Excel 2007绘制图表。

2 结果与分析

2.1 不同破碎方法效果比较

图1-a与图1-b是液氮匀浆法、研磨匀浆法制取的匀浆液40倍镜照片，图1-c与图1-d是机械匀浆法、反复冻融法制取的匀浆液20倍镜照片。图1-a中黑色不规则形状是滤膜碎屑，该视野未见完整藻细胞。图1-b只能看清血球计数板的网格线，视野中的白色为研磨后粉末状的石英砂。图1-c中黑色图案是小钢珠碎屑，该视野未见完整藻细胞。图1-d可见较多完整藻细胞。通过计数，4种方法平均破碎率为：液氮匀浆法81.43%，研磨匀浆法100.00%，机械匀浆法92.41%，反复冻融法56.54%。

注：图1-a和1-b放大倍数为40倍，图1-c和1-d放大倍数为20倍。a，液氮匀浆法；b，研磨匀浆法；c，机械匀浆法；d，反复冻融法

2.2 SOD含量比较

如图2所示，4种匀浆方法中液氮匀浆法和研磨匀浆法小球藻的SOD活力（47.06、48.58 U/mgprot）显著高于其他两种匀浆方法，其他两种匀浆方法小球藻的SOD活性由高到低依次为反复冻融法25.05 U/mgprot，机械匀浆法0 U/mgprot。液氮匀浆法和研磨匀浆法之间差异不显著（＞ 0.05），但显著高于其他两种方法（＜0.05）。

2.3 GSH含量比较

如图3所示，机械匀浆法小球藻的GSH含量（87.37 mgGSH/gprot）显著高于其他匀浆方法。液氮匀浆法（34.42 mgGSH/gprot）、研磨匀浆法（24.52 mgGSH/gprot）和反复冻融法（38.75 mgGSH/gprot）之间差异不显著（＞0.05），与机械匀浆法差异显著（＜0.05）。

3 讨论与结论

目前，有很多单细胞藻类的匀浆方法，物理方法包括研磨匀浆法[9]、机械匀浆法[10]、超声法[11]、微波法[12]等；化学方法包括有机溶剂法[13]、强酸浸提法[14]、强碱浸提法[15]等；生物方法包括细菌法[16]、酶解法[16]、病毒法[17]等。酶解法原理是纤维素酶快速地分解藻类细胞壁，使胞内物质容易释放。酶解法可以一次处理大量样本，但经济成本较高；化学方法破壁效果好，但胞内酶及活性物质易被破坏；物理方法破壁操作简便，对细胞活性物质破坏小，是实验室通常采用的手段。本试验通过比较几种物理方法，发现研磨匀浆法破壁率最高，经30 min研磨破碎率接近100%；机械匀浆法达到90%以上；反复冻融法接近50%。综合考虑破碎效率、经济成本、耗费人力等因素，液氮匀浆法破壁速度快、效率高，30 s即可达到80%的破碎率，是物理方法的最佳选择；研磨匀浆法要获得较高的破碎率，需要耗费大量时间，人工成本巨大，且无法处理大量样本；机械匀浆法购置仪器成本较大；反复冻融法的破壁效果因冻融次数而异，也可以处理大量样本，但耗费的时间较长。

细胞受到胁迫产生活性氧自由基，如O2-·、·OH等，可破坏生物大分子，影响细胞活 性[18-19]。酶类抗氧化剂和低分子清除剂是清除自由基的主要物质，保护细胞免受损伤，SOD与GSH是重要代表。超氧化物歧化酶是生物体内清除超氧阴离子（O2-·）的特异性酶，将其分解为H2O2和O2，是生物体抗氧化的第一道防线[20-21]；还原型谷胱甘肽可以清除对生物体仍有损伤的H2O2，同时也是谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和谷胱甘肽-S转移酶（GST）的底物，对机体抗氧化平衡起到巨大作用[22]。从图2的SOD活力可以看出，研磨匀浆法和液氮匀浆法测定出的结果相近，F检验表明无显著差异（＞0.05），说明大分子物质从细胞进入到匀浆液中，可被检测且蛋白结构未被破坏，测定结果准确。李琦等[23]研究了反复冻融对嗜热链球菌SP1.1的β-半乳糖苷酶和乳酸脱氢酶活力的影响，测定结果仅为0.0656 U、0.897 U，而使用酶解法测定结果为0.387 U、2.375 U，差异显著（＜0.05）。本试验中反复冻融法的测定结果约为其他方法一半，可能是因为反复冻融对酶的活性产生影响。机械匀浆法未检测出SOD，原因可能是巨大剪切力使蛋白质变性，且匀浆过程中无法保证低温，导致SOD失活。从图3可以看出，液氮匀浆法、研磨匀浆法和反复冻融法小球藻的GSH含量差别不明显，机械匀浆法使GSH含量大幅增加，原因可能是细胞内的其他酶或蛋白高级结构和空间构象被破坏，匀浆液中半胱氨酸或含半胱氨酸的多肽含量上升[24]，导致测定结果偏高。

结合破壁效果、便捷性、经济性、生化指标测定的准确性等因素，作者认为液氮匀浆法是实验室进行生理生化指标测定的最佳方法。如果不方便获取液氮，可以采用反复冻融法并增加冻融次数。

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Study on the preparation methods of homogenate chlorella cells

Wang Zhengrun, Yu Jianlin, Kong QingxiaCorrespondingAuthor

（College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

Withas the test organism, four homogenizate methods ,liquid nitrogen method, grinding method, mechanical method, and repeated freeze-thaw method were studied. The homogenation with the above methods was used to determined the SOD activity and GSH content, which aimed to select a method with high crushing efficiency, convenience, and accurate determination of physiological and biochemical indicators. The results showed that the crushing rates of the four methods were 81.43%, 100%, 92.41%, 56.54%, and the SOD activity were 47.06, 48.58, 0, 25.05 U/mgprot. There was no significant difference between liquid nitrogen method and grinding method（＞0.05）; GSH content were 34.42, 24.52, 87.37, 38.75 mgGSH/gprot; There was no significant difference apart of mechanical method（＞0.05）. The above results indicated that the grinding method and liquid nitrogen method have a high crushing rate, and accurate measurement of the biochemical indicators. However, grinding method consumed too much labor and cannot process a large number of samples, so the liquid nitrogen method was considered to be the best solution for preparing microalgal cell homogenation.

; homogenate methods; crushing rate; biochemical indicators

1008-5394（2021）03-0065-04

10.19640/j.cnki.jtau.2021.03.014

X55

A

2020-01-15

天津市水产产业技术体系尾水处理岗位（ITTFR2018047）；天津市动植物抗性重点实验室开放基金项目（无编号）

王政润（1995—），男，硕士在读，主要从事环境毒理学方面的研究。E-mail：305179091@qq.com。

孔庆霞（1978—），女，副教授，博士，主要从事环境毒理学方面的研究。E-mail：xiaokong3155@163.com。

责任编辑：张爱婷