李昕华

(长春市中心医院神经内科 长春 130000)

短暂的轻度缺血即可导致中枢神经系统损伤,小胶质细胞是中枢神经系统内免疫感受和效应细胞[1],对保护脑组织有重要作用。本实验采用体外氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)模型来模拟脑损伤过程,为研究缺血过程中小胶质细胞的脑保护作用提供了可靠、实用的方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

出生1～2d Wistar大鼠。购自吉林大学中心实验室。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠皮层小胶质细胞原代培养和鉴定 采用酶消化法结合机械分离法进行培养[2]。应用倒置显微镜观察不同时期细胞形态及生长情况。在培养第8天用OX42免疫细胞化学染色进行鉴定。

1.2.2 制备小胶质细胞OGD模型及评价 (1)缺氧DHank’s液的制备及缺氧罐的制作。方法同前期研究[3]。(2)小胶质细胞OGD模型的建立及LDH漏出率测定。用缺氧D-Hank’s液洗涤并孵育培养至第8天的小胶质细胞,在缺氧罐中37℃培养;取缺氧时间为30、60、120、180min再复氧24h的细胞检测LDH漏出率,方法按说明书进行。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 小胶质细胞原代培养及鉴定

小胶质细胞在培养第8天分化成熟,OX42阳性细胞百分比为(97.33±2.15)%。

2.2 小胶质细胞OGD模型制备及评价

血气分析仪测量缺氧D-Hank’s液氧浓度＜1%,抽成真空及通入缺氧气体后缺氧罐内氧含量为(1±0.1)%,二氧化碳浓度为(5±0.1)%。小胶质细胞LDH漏出率随缺氧时间延长逐渐增加,OGD60min之后与30min比较LDH漏出率有统计学差异,见表1。

表1 LDH漏出率[（n=48，%）,(±s)]

表1 LDH漏出率[（n=48，%）,(±s)]

注：▲P<0.05 小胶质细胞15min;#P<0.05 小胶质细胞45min

0min 30min 60min 120min 180min小胶质细胞 0.95±0.05 (4.81±0.39)▲ (17.08±1.08)# (29.04±1.96)# (36.38±1.76)#

3 讨论

采用OX42免疫细胞化学染色后,小胶质细胞在倒置显微镜下呈细长或椭圆形,从胞体发出细长而有分支的突起,表面有许多小棘突,97%以上细胞为OX42阳性。本实验可在培养第8天可分离出高纯度的成熟小胶质细胞。

目前有多种脑缺血模型制备方法及操作手段[4],本实验用自行设计生产的缺氧系统培育成熟的小胶质细胞,建立OGD模型,随OGD时间增加,小胶质细胞损伤逐渐增加,OGD60min后损伤明显。实验结果说明本实验采用的OGD方法可明显造成小胶质细胞缺血、缺氧性伤害,可成功模拟中枢神经系统小胶质细胞缺血性损伤。

[1]Bayer AU,Keller ON,Ferrari F,et al.Association of glaucoma with neurodegenerative diseases with apoptotic cell death,Alzheimer's disease and Parkinson's disease[J].Am J Ophthalmol,2002,133,1:135～137.

[2]Simon Moussauda,b,Henning Joerg Draheimb.A new method to isolate microglia from adult mice and culture them for an extended period of time[J].Journal of Neuroscience Methods,2010,187:243～253.

[3]莽靖,李昕华,阎世军,等.大鼠皮层神经元原代培养、鉴定及氧糖剥夺模型的建立[J].中国老年学杂志,2010,6:790～791.

[4]Zhang J,Qian H,Zhao P,et al.Rapid hypoxia preconditioning protects cortical neurons from glutamate toxicity through delta-opioid recepto[J].Stroke,2006,37:1094～1099.