刘义梅 罗焜 陈科力 陈士林

小茴香为临床常用中药，传统中医药理论认为其具有散寒止痛、理气和胃的功效[1]。本品来源于伞形科植物茴香FoeniculumvulgareMill.的干燥成熟果实，有些地区把同科植物莳萝AnethumgraveolensL.、毒芹CicutavirosaL.、孜然芹CuminumcyminumL.、防风Saposhnikoviadivaricata(Turcz.) Schischk、葛缕子CarumcarviLinn.的果实作为小茴香药用[2-5]。这5种混伪品与正品小茴香同样来源于伞形科植物的果实，在形态上同为双悬果，都具有特异香气且显微特征同样具有油室或者油管等，传统的经典鉴定方法难以准确鉴定。随着分子生物学的发展，DNA条形码技术以其不受被检测对象的形态特征以及发育阶段影响等优点而为中药鉴定领域所关注，其热点候选序列—ITS2已被证明在药用植物鉴定方面具有潜在的研究价值[6-11]，本研究运用ITS2序列鉴定小茴香及其常见混伪品，为小茴香药材的快速和准确鉴定提供分子依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验采集小茴香4个样本，材料经中国医学科学院药用植物研究所林余霖副研究员鉴定，凭证标本保存于中国医学科学院药用植物研究所，见表1。其余42个样本6个物种来源于GenBank，见表2。

1.2 DNA提取和PCR扩增、PCR产物纯化及序列测定

样品的DNA提取、PCR扩增及测序的方法均参照文献[7]。

1.3 数据分析

测序获得的峰图利用CondonCode Aligner V 3.7.1(CodonCode Co.,USA)校对拼接。实验数据与GenBank上下载的ITS2序列采用基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法去除两端5.8S和26S，获得ITS2间隔区序列。通过MEGA4.1软件对小茴香不同样本进行种内序列对比，计算小茴香的种内最大K-2-P距离和种间最小K-2-P距离，并构建其NJ系统发育树。利用Schultz等人[12]的研究方法预测各物种ITS2茎环二级结构。

2 结果与分析

2.1 测序峰图

实验序列JF421497的峰图(见图1)，其序列长度为222 bp，其中221个碱基的Q值均大于等于20，具有1个POLY(C)和1个POLY(T)结构，GC含量为55.1%。

图1 实验序列JF421497的峰图

2.2 小茴香不同样本种内序列比对

通过比对17个小茴香样本的ITS2序列，结果显示JF421497、HQ377209、HQ377210、HQ377211、HQ377212、HQ377213、HQ377215、GQ434700、GQ434701、GQ148792、GQ148793、AY581806、FJ980396这11条序列完全相同，HQ377206和HQ377208完全相同，17个样本有4种不同的序列，这4个不同序列的长度为219～222 bp，具有1个POLY(C)和1个POLY(T)结构，GC含量为54.3%-54.9%，平均GC含量为54.8%，共有10个碱基变异，平均K-2P距离为0.0044，种内最大K-2P距离为0.0307。见图2。

表1 实验材料采集地及GenBank登录号

表2 GenBank下载样本物种信息

图2 不同样本小茴香的种内序列比对

2.3 小茴香与易混伪品的种间序列比对

从图3中可以看出，小茴香及其5种混伪品的种间序列共有89个位点变异，信息位点有37个。小茴香及其同属易混伪品的种间平均K-2-P距离为0.2479，最小K-2-P距离为0.0405。

2.4 ITS2序列二级结构

如图4所示，小茴香与其5个混伪品在二级结构上有明显差异。重点差异存在于螺旋I和螺旋III中。小茴香二级结构螺旋I存在7个小茎环和1个大茎环，莳萝为4小茎环和1个大茎环，葛缕子为4个小茎环和2个大茎环，孜然芹为4个小茎环，毒芹和防风为6小茎环和1个大茎环。茴香二级结构螺旋III的茎环在数量、大小及位置与其他物种也存在明显不同，正伪品ITS2二级结构螺旋(Helix)区之间的反转角度也各不相同。因此，ITS2二级结构也可作为鉴定小茴香及其混伪品的一个方法。

图3 小茴香与易混伪品的种间比对

图4 小茴香及其五种混伪品的ITS2二级结构

2.5 小茴香及其混伪品的ITS2序列NJ树鉴定

图5 基于ITS2序列构建的小茴香及其混伪品的邻接(NJ)树(bootstrap1000次重复，枝上数值仅显示自展支持率≥50%，采用k-2p距离法)

从基于ITS2构建的NJ树图可以看出，小茴香具有单系性，不同个体聚在一起，同时也很容易与其混伪品区别开来。因此ITS2序列适用于药材小茴香与其混伪品的鉴定。

3 讨论

本实验通过对小茴香核基因序列进行研究，显示ITS2序列在小茴香基源植物鉴定方面具有以下特点：小茴香ITS2序列较短，约为220 bp，降低了提取、扩增和测序的难度，此特性也将更有利于获取发生降解的样本序列，对于DNA条形码技术在中药材应用具有重要的意义；通过对小茴香及其混伪品数据的分析，发现17样本ITS2序列种内最大K-2-P距离小于种间最小距离。同时，从基于ITS2序列构建的小茴香及其易混品NJ树可以看出，小茴香17个样品聚为一支，支持率为97，明显与其常见混伪品分开。说明通过ITS2序列能很好的区分小茴香及其混伪品；小茴香及其混伪品的ITS2二级结构，都存在4个螺旋区域，各螺旋上的茎环，以及彼此间的夹角存在明显的不同，也说明ITS2二级结构有助于鉴定小茴香及其混伪品。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京:化学工业出版社,2010：210.

[2] 姚仲青,俞明霞.小茴香与其伪品孜然鉴别[J].时珍国医国药,1999,(02)：120-121.

[3] 邓君丽.小茴香及其混淆品莳萝子的鉴别[J].药物分析杂志,1998,(04)：266-267.

[4] 吴俊娇.小茴香及其混伪品的鉴别[J].时珍国医国药,1997,(05)：58.

[5] 解红梅,张丽丽,陈旭.中药小茴香及其非正品的鉴别[J].中华临床医学研究杂志,2007,13(22):3288.

[6] Chen SL, Yao H, Han JP, et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J]. PLoS One,2010,5(1):e8613.

[7] Gao T, Yao H, Song JY, et al. Identification of medicinal plants in the family Fabaceae using a potential DNA Barcode ITS2[J]. J Ethnopharmacol, 2010, 130(1): 116-121

[8] 朱英杰,陈士林,宋经元,等.重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究[J].药学学报,2010,45(3):376-382.

[9] Yao H, Song JY, Liu C, et al. Use of ITS2 Region as the Universal DNA Barcode for Plants and Animals[J]. PLoS ONE, 2010，5(10): e13102.

[10] 陈士林,宋经元,姚辉,等.药用植物DNA条形码鉴定策略及关键技术分析[J].中国天然药物,2009,(5):322-327.

[11] 陈士林,姚辉,宋经元,等.基于DNAbarcoding(条形码)技术的中药材鉴定[J].世界科学技术,2007,9(3):7-12.

[12] Schultz J, Müller T, Achtziger M, et al. The internal transcribed spacer 2 database-a web server for(not only)low level phylogenetic analyses[J]. Nucleic Acids Res. Suppl., 2006, 34: W704-707.