廖晶晶 徐建国 杨伟俊 刘冲 地力努尔 满尔哈巴

唇形科新塔花属ZiziphoraL.在中国分布4种，均产新疆，其中芳香新塔花(Z.clinopodioidesLam.)资源最为丰富，生长于南北疆各山区的山地草地、砾石质坡地及半荒漠草滩上。由于其独特的芳香气味，也是一种牛羊等牲畜喜食的牧草。芳香新塔花药用地上部分，系维吾尔医和哈萨克医习用药材，性“二级干寒”。芳香新塔花具有强心利湿，理气化痰，消炎散结之功能，用于心脏病，气短多汗，水肿，气管炎等疾患[1]；也可用于感冒发热，高血压，心悸失眠等症[2]。中医临床上也用于治疗高血压以及心肌缺血[3，4]。芳香新塔花具强烈的芳香气味，地上部分含挥发油、萜类、生物碱、黄酮类等[5-9]。课题组从事芳香新塔花药材繁育、规范化种植、化学研究及新药开发等方面的研究工作多年，首次起草并制定了芳香新塔花药材的质量标准[10]。通过对中国新塔花属进行系统研究后发现，芳香新塔花具有显著的药理活性[11]，采用药效活性追踪的研究方法，从具有活性的部位中分离得到了一系列黄酮类化合物[9]，并采用溶剂提取、大孔吸附树脂分离纯化得到芳香新塔花总黄酮有效部位(Z. clinopodioides flavonoids，ZCF)。本实验通过研究ZCF体外抗氧化活性以及对缺氧—复氧损伤和氧化损伤的心肌细胞的影响，为进一步探索药效物质基础提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SD大鼠乳鼠(出生1～3天)，雌雄不限，均由新疆医科大学动物实验中心提供，合格证号：新医动字SYXK(新)2003-0001。

1.2 药物

芳香新塔花黄酮(ZCF)，新疆维吾尔自治区药物研究所维吾尔药研究室制备，纯度71.0%，黄色粉末。

1.3 试剂

二苯代苦味酰自由基 (2,2-diphenyl-l- picrylhydrazyl，DPPH·)，购自美国Sigma公司。MTT，Amresco公司，批号：080717。胰酶，Amresco0458，批号：081011。链霉素，华北制药股份有限公司产品，批号081112。DMEM培养粉(高糖、低糖)，Invitrogen Corporation产品，批号：081004。注射用氨苄西林钠，中诺药业有限公司生产，批号：081120。其它所用试剂均为分析纯。丙二醛(MDA)测试盒，批号：090103，100T，南京建成生物工程研究所生产。

1.4 仪器

DG-5031型酶联免疫检测仪，华东电子集团医疗装备有限责任公司产品；Shimadzu UV-2501 紫外可见分光光度计(日本岛津制造所)；BS124S电子天平(塞多利斯)；。

1.5 ZCF清除 DPPH·实验

精确吸取ZCF贮备液，用乙醇稀释为0.01 mg/ml、0.0125 mg/ml、0.0167 mg/ml、0.025 mg/ml、0.05 mg/ml的系列溶液，取各浓度溶液2 ml，加入2 ml 2×10-4mol·L的DPPH·，摇匀，反应30 分钟 后，在紫外可见分光光度计上，517 nm波长处测定吸收值，记录吸光度值为A样品。用2 ml无水乙醇加入2 ml 2×10-4mol·L的DPPH·溶液为空白对照，摇匀，反应30 分钟测得的吸光度为A空白对照，计算公式为：DPPH·清除率(%)=[1-A样品/A空白对照]×100%。

同上法，测定不同浓度维生素C(VC)溶液的A样品VC，A空白对照VC。

1.6 ZCF对培养乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用[12]

1.6.1 乳鼠心肌细胞原代培养 出生1～3天SD大鼠乳鼠，无菌取出心脏，冷PBS溶液清洗后剪碎成约1～3 mm3的小块，0.25%胰酶分次消化，再离心分离细胞，用DMEM(含10%胎牛血清)悬浮转移并接种于培养瓶中，差速贴壁纯化法，除去成纤维细胞。初步纯化后的乳鼠心肌细胞悬液(1×105/ml)分别接种并培养3～4天，用于实验。

1.6.2 细胞存活率实验 心肌细胞与不同浓度的药物共育24 小时后，弃去培养液，每孔加无血清的DMEM 180 μl和MTT 20 μl，培养4 小时，除去上清，每孔加DMSO 150 μl，混合均匀后，10 分钟内在570 nm处测吸光度(A)值。

1.6.3 缺氧—复氧模型的建立 心肌细胞培养72 小时后，用缺氧液(预先用高浓度氮气饱和的培养液)置换正常培养液，放入缺氧培养箱(氮气99.99%)，缺氧120分钟，再用模拟再灌注液置换复氧液(预先用纯氧饱和培养液)于5% CO2、37℃温箱中复氧60分钟，用硫代巴比妥酸显色法测MDA的量。

1.6.4 试药对乳鼠心肌细胞缺氧—复氧的影响 由细胞存活率实验确定ZCF实验剂量，并将实验分为6组：正常细胞培养组(培养板置培养箱中持续孵育3 小时结束实验)；缺氧—复氧损伤模型组(缺氧2 小时，复氧1小时)；缺氧—复氧损伤+ZCF各剂量组(缺氧2 小时，复氧1 小时，缺氧—复氧时均给药)。以不加试药的细胞培养液孔的吸光度均值与加试药各孔的吸光度均值之比作为抑制率，取2次测定的抑制率的平均值作为最终抑制率。

1.7 统计学方法

采用SPSS 10.0统计软件，数据处理用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZCF清除DPPH自由基实验结果

以DPPH·清除率对ZCF浓度作图，发现ZCF及VC对DPPH ·有较好的清除作用，且ZCF对DPPH·的清除作用与ZCF及VC的添加量呈正相关，量效关系显著。线性回归方程为y = 17.93 x-3.31，r2= 0.9951。得出ZCF的半数清除浓度IC50= 0.017 mg/ml。同法算得VC的半数清除浓度IC50= 0.01 mg/ml。结果见图1。

图1 ZCF清除DPPH·实验结果

2.2 ZCF对培养的乳鼠心肌细胞缺氧—复氧损伤的保护作用

2.2.1 MTT测定结果 ZCF剂量低于12.5 μg/ml剂量组时，对心肌细胞缺氧—复氧损伤的抑制率在50%左右。结果见表1。

表1 不同浓度芳香新塔花总黄酮

2.2.2 MDA测定结果 与正常组比较，模型组的MDA水平显著降低(P﹤0.01)，说明模型成立。与模型组比较，ZCF各剂量组MDA的量均下降且呈剂量依赖关系，高、中、低三个剂量组MDA与模型组的差异非常显著(P﹤0.01)。结果见表2。

表2 ZCF对培养的乳鼠心肌细胞缺氧—

3 讨论

黄酮类化合物亦称类黄酮或生物类黄酮，主要是指基本母核为2-苯基色原酮类化合物，其基本结构式由两个苯环(A和B)通过中间杂环的吡喃或吡喃酮(C)相连接，具有15个碳原子的多元酚化合物，广泛存在自然植物中，有多种生物学活性。近年来国内外学者对其进行了大量的研究，证实黄酮类化合物具有抗自由基、抗肿瘤、抗病毒作用，对心脑缺血损伤、肝损伤、心律失常有保护作用，此外，还有降压、降血脂、抑制血小板聚集等多种药理作用。现已证明心血管疾病的发生和发展与自由基对心肌组织细胞的损伤关系密切。DPPH·是一种稳定存在的有机自由基，由于苯环的内轭和位阻及硝基的吸电子作用，呈现紫色被还原后变为浅黄色，通过测定反应体系在517nm附近的吸收峰的下降程度可以直接评价其抗氧化活性，变化程度与自由基清除程度呈线性关系，这种方法广泛用于植物材料的总抗氧化活性的评价和抗氧化剂的筛选。本文试验结果显示，ZCF的IC50为0.017 mg/ml，而VC的IC50为0.01 mg/ml。说明ZCF具有较强的自由基清除作用。

心肌细胞缺氧—复氧模型可分别造成模拟心肌缺血与缺血后再灌注损伤模型，而在此模型中自由基损伤起着关键性作用[13]，心肌缺血—再灌注后，机体通过多种途径产生氧自由基，氧自由基介导的细胞膜及亚细胞膜脂质过氧化是心肌缺血再灌注损伤的重要环节，而MDA是自由基攻击生物膜引发脂质过氧化反应的产物，其量可反映脂质过氧化程度，可作为评价氧自由基攻击程度的指标[14]。在本实验中，心肌细胞在缺氧—复氧后，培养液中MDA的量显着增加，而加入ZCF后，MDA含量均有明显下降，表明ZCF能提高心肌细胞抗氧化能力，对心肌细胞缺氧—复氧具有一定的保护作用。

本实验采用DPPH·清除活性方法来评价其对自由基的清除能力，并通过ZCF对培养乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用的影响，利用MDA的含量来观察细胞受自由基攻击程度，结果提示ZCF保护心肌损伤的机制可能与其抑制脂质过氧化，增强心肌细胞抗氧化能力有关。

[1] 刘勇民.维吾尔药志(上册)[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：449.

[2] 徐新，巴哈尔古丽.哈萨克药志(第一卷)[M].乌鲁木齐：民族出版社，2009：119-121.

[3] 洪秀芳，邹阳春，温志高，等．新塔花片治疗高血压病76例[J]．新疆中医药，1995，13(1)：13-15．

[4] 邹阳春，洪秀芳．新疆新塔花对高血压病人脂质过氧化反应及血压水平的干预研究[J]．新疆医学院学报，1994，17(2)：97-100．

[5] Ozturk S，Ercisli S. Antibacterial activity and chemical constitutions of Ziziphora clinopodioides[J]. Food Control，2007，18(5):535-540.

[6] 石峰，杨伟俊，顾政一,等．芳香新塔花挥发油的化学成份分析[J]．新疆中医药，2009，27(1)：23-24.

[7] 杨小菊，李宁，孟大利，等．芳香新塔花化学成分的分离与鉴定[J]．沈阳药科大学学报，2008，25(6)：456-458.

[8] Oganesyan GB, Galstyan AM, Mnatsakanyan VA, et al. Phenols and flavonoids of Ziziphora clinopodioides [J]. Khimiya Prirodnykh Soedinenii, 1991(2): 286-287.

[9] 杨伟俊，顾政一，满尔哈巴，等.芳香新塔花中黄酮类成分的研究[J].时珍国医国药，2011，22(2)：375-376.

[10] 杨伟俊，何江,满尔哈巴，等. 芳香新塔花药材质量标准的研究[J]．中国实验方剂学杂志，2010，16(10)：65-68.

[11] 杨伟俊，哈木拉提，孙玉华，等. 芳香新塔花对大鼠急性心肌缺血和乳鼠心肌细胞的保护作用 [J]．现代药物与临床，2010,25(3):214-218.

[12] 余薇，李璐，姚社，等.大蒜多糖对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用[J].中国药理学通报，2010，26(5)：697-699.

[13] 倪岚，陈飞. 银丹心脑通胶囊对缺氧复氧心肌细胞损伤的抗氧化作用[J]．中西医结合心脑血管病杂志，2008，6(11):1308-1309.

[14] 梁启明，曲绍春，于晓风，等. 刺五加叶皂苷对乳鼠心肌细胞氧化应激损伤的保护作用[J]．中国中药杂志，2009，34(19)：2489-2493.