邓林强，陈 会，郭建军，孙 敬，余理智，熊章华

(1.江西省人民医院检验科，江西 南昌 330006；2、浙江台州骨伤医院检验科，浙江 台州 317500)

100株肺炎链球菌耐药性分析

邓林强1，陈 会1，郭建军2，孙 敬1，余理智1，熊章华1

(1.江西省人民医院检验科，江西 南昌 330006；2、浙江台州骨伤医院检验科，浙江 台州 317500)

目的了解肺炎链球菌耐药情况和β-内酰胺类抗生素MIC浓度检测的意义。方法对我院收治的社区获得性肺炎患者中呼吸道标本分离出的100株肺炎链球菌进行7种抗菌药物MIC浓度检测和苯唑西林 (OX)的K-B法检测。结果①100株肺炎链球菌中，耐青霉素肺炎链球菌占13%；头孢噻肟和左旋氧氟沙星的耐药率都为6%；对红霉素、克林霉素和四环素耐药率分别为84%、80%和88%；对万古霉素则全敏感。②K-B法检测出苯唑西林敏感59株(占59%)。 结论 本院收治的社区获得性肺炎患者中的肺炎链球菌对部分抗生素耐药性比较严重，但青霉素仍具有较好的体外抗菌活性。且β-内酰胺类抗生素进行MIC浓度测定是有必要的。

肺炎链球菌；耐药率；苯唑西林；MIC

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是社区获得性肺炎的主要病原体，具有很高的发病率和病死率(尤其是老人和儿童)。在发展中国家，每年有500万5岁以下的儿童死于肺炎链球菌引起的肺炎，10～50万儿童死于肺炎链球菌引起的脑膜炎[1]。近年来肺炎链球菌引起的呼吸道感染已被列为研究重点之一[2]，耐药率也逐年上升。为了解肺炎链球菌耐药情况,现将我院2009年1月至2010年12月期间收治的社区获得性肺炎患者呼吸道标本中分离出的100株肺炎链球菌的耐药性进行分析,报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 100株肺炎链球菌为我院2009年1月至2010年12月收治的社区获得性肺炎患者标本中分离菌株。

1.1.2 培养基、药敏纸片和试剂 MH琼脂粉、苯唑西林(OX)纸片和 Optochin纸片(5μg/片)购自 OXOID公司(英国)。5%羊血琼脂平板为本实验室自制。肺炎链球菌鉴定及药敏鉴定卡购自BD公司(美国)。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离与鉴定

1.2.1.1 标本接种按操作规程[3]进行，标本直接涂片：①WBC大于25个/LP，EPC小于10个/LP；②见G+双球菌，呈“矛头状”或“瓜子仁”状排列；③WBC吞噬或伴行G+双球菌。将接种了标本的平皿置6%CO2孵箱过夜培养。分离菌株经革兰染色后，用BD公司的链球菌鉴定与药敏卡进行鉴定和MIC浓度测定。

1.2.1.2 Optochin敏感性试验 配制0.5麦氏单位菌液,用无菌棉签蘸取菌液均匀涂抹于含5%羊血MH琼脂平板，10min后贴Optochin纸片一片,将平皿置35℃、6%CO2孵箱过夜培养。抑菌环直径≥14mm为敏感。

1.2.1.3 胆汁溶解试验(试管法)分别取1ml 6麦氏单位菌液于2只试管中，于一管菌液中加0.1ml 10%去氧胆酸钠溶液,另一管中加0.1ml无菌生理盐水，混匀后，置35℃孵箱15min取出，摇匀后观察结果。加盐水管菌液浊度不变，加去氧胆酸钠溶液管菌液变澄清，判为胆汁溶解试验阳性。

1.2.1.4 分子生物学鉴定 从待测菌中提取自溶素(lytA)基因并进行PCR扩增，并对扩增后的产物进行BsaAI酶切。1.5%琼脂糖凝胶电泳(75V，60min)，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下观察，结合DNA Marker判断若出现761bp、452bp两条带即为典型的肺炎链球菌lytA基因。

1.2.2 药敏试验方法 OX药物敏感试验和Optochin敏感性试验采用CLSI2010版推荐的纸片扩散法(KB法)进行；其他药物的MIC浓度由BD Phoenix 100检测；并根据CLSI 2010年版判断标准进行药敏结果判断。

1.3 质控菌株 以上材料与方法所需用的质控菌株分别为金黄色葡萄球菌ATCC 25923和肺炎链球菌ATCC 49619。

2 结果

2.1 我院2009年1月至2010年12月收治的社区获得性肺炎患者标本中分离出的100株肺炎链球菌，耐青霉素肺炎链球菌(PRSP，MIC≥8μg/ml)13株(占 13%)，中介(PISP)8 株(占 8%)，敏感(PSSP)79 株(占79%)；头孢噻肟和左旋氧氟沙星的耐药株都为6株(占6%)；对头孢噻肟中介的肺炎链球菌有4株(占4%)，而对左旋氧氟沙星中介株为1株(占1%)；对红霉素、克林霉素和四环素耐药率比较高，分别为84%、80%和88%；对万古霉素则全敏感。

2.2 100株肺炎链球菌经纸片扩散法(K-B法)测定，OX敏感(抑菌圈≥20mm)59株(占59%)。OX抑菌圈直径≤19mm的41株肺炎链球菌(经MIC测定)对青霉素耐药 13株(占 31.71%)、中介 8株(占 19.51%)、敏感20株 (占48.78%)；对头孢噻肟耐药6株 (占14.63)、 中介4株 (占9.76%)和敏感31株 (占75.61%)。

2.3 100株肺炎链球菌如以CLSI 2008版以前的判断标准进行药敏结果判断，青霉素和头孢噻肟的耐药率将大大增加。其中青霉素的耐药率为33%，而头孢噻肟的耐药率为13%。

3 讨论

肺炎链球菌是社区获得性感染的重要病原菌，自1967年澳大利亚Hansman等[4]首次分离出青霉素不敏感肺炎链球菌(PNSSP)以来，PNSSP在世界范围内迅速传播，近年来耐药率迅速升高。实验室在检测青霉素及其它β内酰胺类抗生素药敏时，由于还没有可靠的纸片扩散法药敏试验，因此，用OX代替青霉素及其它β-内酰胺类抗生素。即当OX抑菌圈≥20mm的肺炎链球菌分离株对青霉素敏感。当OX抑菌圈直径≤19mm时，就应检测青霉素和头孢噻肟的MIC值[5，6]。而本试验数据显示OX敏感59株。41株OX抑菌圈直径≤19mm的肺炎链球菌经MIC测定，对青霉素和头孢噻肟耐药仅分别为13株(占 31.71%)和 6 株(占 14.63)。

2008 年以前美国临床实验室标准化协会公布的 《抗微生物药物敏感性试验执行标准》(即CLSI 2008及以前版本)判定肺炎链球菌对青霉素最低抑菌浓度(MIC)的标准为：≤0.06μg/ml为敏感[5]。CLSI 2009及以后版本对此进行了修改，标准改为：非脑膜炎时≤2μg/ml为敏感，4μg/ml为中介，≥8μg/ml为耐药；脑膜炎时≤0.06μg/ml为敏感，≥0.12μg/ml为耐药(没有中介)[6]。判断标准的改变就使得社区获得性肺炎中分离出的肺炎链球菌对青霉素的敏感率大幅升高。这也就是本文中青霉素的耐药率由33%降低到的13%，并出现8%中介的原因之一。头孢噻肟的耐药率降低也可能是出于此。

试验中所分离出的100株肺炎链球菌对红霉素、克林霉素和四环素呈高水平耐药，其中对红霉素的耐药率为84%(84株)，对克林霉素的耐药率为80%(80株)，对四环素的耐药率为88%(88株)，这与国内的报道相近[7-10]。其耐药机制可能与erm基因介导核糖体靶位修饰、mef基因介导的主动外排机制和50S核糖体突变有关。肺炎链球菌对左旋氧氟沙星和万古霉素都很敏感，万古霉素的敏感率达到100%。

综上所述，本院收治的社区获得性肺炎患者中的肺炎链球菌对部分抗生素耐药性比较严重，但青霉素仍具有较好的体外抗菌活性。

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R378.1+4,R446.5,Q939.92

B

1674-1129(2011)06-0633-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2011.06.021

江西省卫生厅课题，编号：20070324