黄至澄，徐黔宁，闫李侠，陈保文，王国治

(1、台州市第一人民医院，浙江 台州 318020；2、中国药品生物制品检定所，北京 100050)

常见分枝杆菌种内不同株之间16S rRNA基因和16S-23S rRNA ITS序列分析结果的比较

黄至澄1，徐黔宁1，闫李侠，陈保文2，王国治2

(1、台州市第一人民医院，浙江 台州 318020；2、中国药品生物制品检定所，北京 100050)

目的针对常见分枝杆菌不同株对其基因序列进行分析，比较分析结果。 方法 利用16S rRNA Gene和16S-23S rRNA ITS(转录间隔区序列)分析法分别对97株共7种DSMZ/ATCC引进的常见分枝杆菌进行种内不同株之间基因差异性分析，对比两种分型结果的异同。结果16S rRNA基因可将13株草分枝杆菌分为3个型别，18株偶发分枝杆菌分为6个型别，17株耻垢分枝杆菌分为4个型别，8株戈登分枝杆菌分为3个型别，9株龟分枝杆菌龟亚种分为3个型别，15株堪萨斯分枝杆菌分为2个型别，17株产鼻疽分枝杆菌分为1个型别；而16S-23S rRNA ITS可依次将上述分枝杆菌分为3个、15个、7个、3个、4个、3个、5个型别。结论16S rRNA Gene分析和16S-23S rRNA ITS分析均是分枝杆菌基因型分析的可靠方法，此外，16S-23S rRNA ITS的种内多态性高于16S rRNA Gene。

分枝杆菌；16S rRNA；16S-23S rRNA ITS(转录间隔区)；基因型

16 S rRNA基因作为原核生物分类的分子标志，已得到广泛应用，但因序列较长，直接测序困难，常以16S rRNA部分片段作为细菌鉴定标志。16S-23S rRNA ITS(转录间隔区)序列，进化速率比16S rRNA大10倍，在细菌的不同属种中拷贝数、碱基排列顺序以及内含的tRNA基因的数量和种类不同，序列大小比16S rRNA更具直接测序优势。如果两种结合，菌种鉴定效果较好。这种方法对于分枝杆菌同样适用。但是，现在较少有将两者结合鉴定种内参考菌株，它们对种内不同株的鉴别效果还不明确，且少数分枝杆菌的16S rRNA和部分16S-23S rRNA ITS没有在基因库中公布[1]，以至于新发现的细菌无法用序列比对区分。用此方法，我们对德国微生物和细胞保藏中心 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ)和中国微生物保藏中心(China Collection of Microorganisms Culture Center，CMCC)的7种共97株分枝杆菌的参考菌株分别予以序列分析，为临床鉴定提供对照标准。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株：实验所用分枝杆菌7种共97株均由ATCC或DSMZ引进并在中国医学细菌保藏管理中心保藏。

1.1.2 PCR引物和测序引物：参考文献[2]中使用的引物。

1.2 方法 DNA制备、PCR扩增、核苷酸序列分析均参考文献[2]中的方法。

2 结果

2.1 分枝杆菌基因扩增：成功完成97株分枝杆菌16S rRNA Gene和16S-23S rRNA ITS PCR扩增；与目的条带大小相符。

2.2 分枝杆菌基因序列测定：完成97株分枝杆菌16S rRNA Gene和16S-23S rRNA ITS的上、下游序列测定，得到其双向拼接结果。

2.3 在对7种包括97株分枝杆菌进行种内不同株的序列分析时发现16S rRNA Gene分析可将13株草分枝杆菌分为2个型别，相似性百分比为96～100%；18株偶发分枝杆菌分为6个型别，相似性百分比为90～100%；17株耻垢分枝杆菌分为4个型别，相似性百分比为91～100%；8株戈登分枝杆菌分为3个型别，相似性百分比为91～100%；9株龟分枝杆菌龟亚种分为3个型别，相似性百分比为97～100%；15株堪萨斯分枝杆菌分为2个型别，相似性百分比为99－100%；17株产鼻疽分枝杆菌分为1个型别，相似性百分比为100%。而16S-23S rRNA ITS可依次将上述分枝杆菌分为3个，15个，7个，3个，4个，3个，5个型别；相似性百分比依次为74～100%，53～100%，49～100%， 86～100%，65～100%，90～100%，77～100%

3 讨论

16 S rRNA，16S-23S rRNA ITS分析可将细菌鉴别到属与种，比较RAPD(随机引物PCR)或RFLP(限制性片段长度多态性分析)该方法兼顾了凝胶电泳与测序分析，扩增产物直接测序用于细菌鉴定。通过核酸序列分析进行细菌鉴定的空间很大，尤其对难培养细菌和新病原微生物的发现意义重大，但是由于操作复杂、直接测序结果不稳定、需要特殊投备投入、试剂成本高等原因，该技术在临床诊断中的应用仍然有限。国内已有不少研究将16S rRNA，16S-23S rRNA ITS分析用于临床上各种致病菌的鉴定[3-10]。我们对DSMZ和CMCC的7种共97株分枝杆菌的16S rRNA Gene、16S-23S rRNA ITS序列进行了比对，主要是种内各株之间差异性：相对16S rRNA Gene而言，16S-23S rRNA ITS的种内多态性较高，即前面我们提到的，16S rRNA Gene高度保守而相对变异，16S-23S rRNA ITS则高度变异而相对保守。如果用16S-23S rRNA ITS来鉴定，可以将这些细菌种内各株分为更多的基因型，据此，就使鉴定达到株的水平。两种分型的结果有相似之处，即16S rRNA Gene能鉴别的菌株，16S-23S rRNA ITS同样可以鉴别；但也稍有区别，即16S-23S rRNA ITS还可以鉴别16S rRNA Gene不能鉴别的菌株，例如：在耻垢分枝杆菌中两种方法都可以把93428、93397、93381各分为一型，但 16S-23S rRNA ITS还可以把95023、93426、93400分别与其他型分开，根据16S rRNA Gene却不能达到这个效果。在两者均能鉴别的菌株中，16S rRNA Gene的相似性百分比明显高于16S-23S rRNA ITS：在耻垢分枝杆菌中93428与93397的16S-23S rRNA ITS相似性为88%；93397与 93381的相似性为 52%；93428与93381的相似性为53%；而相对应的16S rRNA Gene的相似性分别为96%、91%、91%。因此，鉴于两种基因不同的特点，我们认为16S rRNA Gene不适合做种内不同株之间的分型和鉴定区分，16S-23S rRNA ITS则更适合。

分枝杆菌16S rRNA Gene和16S-23S rRNA ITS序列分析是一种重要的流行病学工具，对于暴发流行时传染源的追踪、解释分枝杆菌病的复发和再染以及实验室交叉污染等方面的研究具有十分重要的意义。现有一些报道指出16S rRNA Gene和16S-23S rRNA ITS在临床致病菌鉴定中有较大的价值。但是，将其用于临床还有一段距离，其原因是缺乏一个可靠的质控数据库，国内的研究者，比如李国利[1]，彭涛[11]等做临床分离株鉴定时，一些分枝杆菌在GenBank序列检索中找不到完全一致的匹配序列，这说明分枝杆菌基因数据库数据不全，有些数据信息可能还有错误，因此，数据库资料不全导致新发现的分枝杆菌无法鉴定。针对DSMZ的7种常见分枝杆菌的所有菌株，本研究进行了上述两种不同基因片段的测序和分析，所用菌株都来自菌种库，是已知菌株，上、下游测序保证了序列的准确性，所以，其序列可作为临床分离株鉴定的标准参考序列。这些序列提交至GenBank中就能补充基因数据库，实现国内外资源共享，为分枝杆菌的鉴定提供依据。

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Analysis of the genotypes among different strains of common Mycobacteria based on 16S rRNA gene and 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences

HUANG Zhicheng,XU Qianning,YAN Lixia,et al.Taizhou First People＇s Hospital,Zhejiang Taizhou 318020,China

ObjectiveTo analyze the genotypes of different strains of common Mycobacteria.MethodsThe different genes from 97 strains introduced Mycobacteria composed of 7 species DSMZ/ATCC were detected using 16S rRNA gene and 16S-23S rRNA internal transcription space (ITS)sequence method.Results13 M.phlei strains,18 M.fortuitum strains,17 M.smegmatis strains,8 M.gordonae strains,9 M.chclonae strains,15 M.kansasii strains and 17 M.farcinogenes strains could be discriminated to 3,6,4,3,3,2 and 1 genotypes by16S rRNA gene;and discriminated to 3,15,7,3,4,3 and 5 genotypes by 16S-23S rRNA ITS gene respectively.Conclusions The analysis of 16S rRNA gene and 16S-23S rRNA ITS gene sequence is reliable method to discriminate Mycobacteria.The polymorphism of 16S-23S rRNA ITS gene is higher than that of 16S rRNA gene in intraspecies of Mycobacteria.

Mycobacteria；16S rRNA；16S-23S rRNA internal transcription space；Genotype

R378.91,R446.5

A

1674-1129(2011)06-0587-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2011.06.002

国家科技重大专项课题（艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治-重大传染病诊断产品质量评价综合技术平台2009ZX10004-805)

黄至澄，男，硕士，台州市第一人民医院急诊科。

陈保文，Email:tbtestlab@163.net