王玉水 王志华 卢金海

肺炎支原体(MP)已成为儿童呼吸道感染的重要病原体之一。肺炎支原体肺炎(MPP)近年来发病率呈上升趋势，且易引起多种肺外并发症，是儿童社区获得性肺炎的常见病原体之一[1]。临床上治疗MPP的首选药物为大环内酯类抗生素，但单独使用该类药物对于难治性及重症MPP疗效欠佳。临床实践证实，对于这些患者在抗感染治疗的基础上加用糖皮质激素可取得很好的疗效。有报道MP所致的严重肺损伤一般认为是宿主的严重免疫反应，而不是MP的直接侵入[2,3]。但目前MPP的发病机制仍不明确，主要倾向于MP对呼吸道上皮的吸附作用、MP的直接侵入和免疫学发病机制等学说[4]。本实验建立大鼠MPP模型，观察在大环内酯类基础上加用糖皮质激素对MPP肺组织病理学的改变，为临床应用糖皮质激素治疗MPP提供理论依据。

1 方法

1.1 实验动物及试剂 4～6周龄SPF级雄性SD大鼠95只，体重(140±20)g，购自中国医学科学院放射研究所。MP标准株MAC由丹麦Statens Serum研究院Jorgen Skov Jensen教授惠赠；1640培养基购自美国Sigma公司。阿奇霉素(辉瑞制药有限公司)、地塞米松磷酸钠(天津金耀氨基酸有限公司)。病理切片机(CUTSO62，德国)。

1.2 MP复苏培养 将MAC菌株从-80℃冰箱中取出，于37℃水浴中迅速解冻(<1 min)。在无菌操作台上用微量加样器将融化的菌液100 μL加入900 μL液体1640培养基中，于37℃，5%CO2条件下培养。同时置于未接种菌液的空白培养基对照管。当培养基颜色由红变黄且对照管不变色时，说明MP生长，将变色培养基传代，以菌落计数法确定菌株浓度。

1.3 MPP模型的建立 大鼠均在3级清洁动物实验室饲养3 d以适应环境，后随机分为4组：阿奇霉素组、地塞米松组、阿奇霉素+地塞米松组和对照组。对照组20只，其余每组25只。各组大鼠均予MP菌液(1×106CFU·mL-1)缓慢滴入大鼠鼻腔，随大鼠自然呼吸进入肺部，每天给予100 μL,共4 d。

1.4 各组干预方法 各组均在MP最后1次接种后第2天开始干预，阿奇霉素组皮下注射阿奇霉素10 mg·kg-1·d-1(浓度为10 mg·mL-1，以生理盐水配制)，地塞米松组腹腔注射地塞米松磷酸钠0.5 mg·kg-1·d-1(浓度为0.5 mg·mL-1，以生理盐水配制)，阿奇霉素+地塞米松组予阿奇霉素10 mg·kg-1·d-1和地塞米松磷酸钠0.5 mg·kg-1·d-1，对照组予相同体积生理盐水；均给予10 d。用药后第1、3、5、8和10天后以颈椎脱臼处死大鼠(每观察时点阿奇霉素组、地塞米松组、阿奇霉素+地塞米松组各处死5只大鼠，对照组处死4只大鼠)，留取肺组织备用。

1.5 组织病理学评分 将大鼠左肺用4%多聚甲醛缓慢灌注后，置于4%多聚甲醛中固定12 h，常规石蜡包埋、切片，行苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察。由专业病理医生在不知情的情况下对肺的全部被检玻片进行检测。

依据文献[5]的方法对肺组织的炎症浸润程度进行评分，共包括5个方面：①细支气管周围/支气管浸润部位的百分率：0=0分，～25%=1分，～75%=2分，>75%=3分；②细支气管/支气管周围淋巴细胞浸润的定性：无或偶见轻微浸润或支气管周围淋巴样细胞团块=0分；不正常，常伴有间断的环=1分；完整的环或新月形的环，伴有<5个细胞的厚度=2分；完全的环，伴有>5～10个细胞的厚度=3分；③细支气管/支气管腔渗出：0=0分，～25%腔闭合=1分；>25%腔闭合=2分，>50%腔闭合=3分；④血管周围浸润部位的百分率：0=0分，～10%=1分，～50%=2分，>50%=3分；⑤实质性肺炎：无=0分，斑状实质性浸润=1分，斑状融合的实质性浸润=2分。总评分计算为①+3(②+③)+④+⑤，总评分为0～26分。分数越高，提示肺组织的炎症浸润程度越高。

2 结果

2.1 MP形态 MP培养后，光学显微镜下MP呈煎蛋花样的典型改变(图1)。

2.2 各组肺组织病理学改变

治疗后第1天：对照组可见较多支气管浸润部位，周围有淋巴细胞样团块(图2A) ；阿奇霉素组可见肺实质有损伤和炎症细胞浸润，肺泡破裂(图2B)；地塞米松组可见血管周围及肺实质较多淋巴细胞浸润(图2C)；阿奇霉素+地塞米松组可见肺实质及血管周围较多淋巴细胞浸润(图2D)。

图1 MP光学显微镜下形态(×100)

Fig 1 Morphology of MP under light microscope(×100)

治疗后第3天：对照组仍可见支气管和血管淋巴细胞浸润(图2E)，阿奇霉素组可见支气管周围仍有淋巴细胞浸润，伴有间断的浸润环(图2F)；地塞米松组可见支气管腔内少量淋巴细胞浸润(图2G)；阿奇霉素+地塞米松组可见细支气管周围淋巴细胞浸润减轻(图2H)。

治疗后第5天：对照组可见细支气管及血管周围较多淋巴细胞浸润(图2I)；阿奇霉素组可见支气管周围淋巴细胞浸润减轻，腔内炎性渗出减少(图2J)；地塞米松组可见细支气管炎症及淋巴细胞浸润仍较明显(图2K)；阿奇霉素+地塞米松组可见支气管周围淋巴细胞浸润减轻，腔内炎性渗出基本消失(图2L)。

治疗第8天：对照组仍可见超过50%的支气管有淋巴细胞浸润，血管周围出现浸润(图2M)；阿奇霉素组可见终末支气管周围少许淋巴细胞浸润(图2N)；地塞米松组可见支气管周围淋巴细胞浸润较前略减轻，气管内无炎性渗出(图2O)；阿奇霉素+地塞米松组可见细支气管炎症较轻，周围少许淋巴细胞浸润(图2P)。

治疗第10天：对照组可见肺组织及血管周围淋巴细胞浸润仍>50%(图2Q)；阿奇霉素组可见终末支气管周围淋巴细胞浸润<25%(图2R)；地塞米松组可见细支气管周围淋巴细胞浸润>25%(图2S)；阿奇霉素+地塞米松组可见终末支气管周围淋巴细胞浸润<25%(图2T)。

2.3 各组肺组织病理学评分比较 各组肺组织病理学评分显示，对照组治疗后不同时点，肺组织病理学评分均维持在较高水平，显著高于阿奇霉素组和阿奇霉素+地塞米松组；地塞米松组治疗后第1和3天肺组织病理学评分处于较低水平，之后呈显著增高趋势，提示炎症浸润程度的加重；阿奇霉素+地塞米松组在治疗后第3天肺组织病理学评分下降；阿奇霉素组和阿奇霉素+地塞米松组在治疗后第5、8和10天均呈下降趋势，其中阿奇霉素+地塞米松组低于阿奇霉素组(表1)。

表1 各组大鼠不同时点肺组织病理学评分比较

Notes 1) indicating tests across difference time pionts; 2) indicating the tests among difference intervention; 3)vscontrol group,P<0.05; 4)vsdexamethasone group,P<0.05; 5)vsazithromycin+dexamethasone group,P<0.05

3 讨论

本研究建立MPP大鼠模型，光镜下可见MP呈蛋花样的特征性改变，保证了MP培养的可靠性。同时对照组在治疗后第1天观察到支气管炎症细胞浸润，肺组织病理学评分较高，表明出现了较为严重的炎症反应，提示本研究建立的MPP大鼠模型较为成功。以抑制蛋白合成的大环内酯类药物是目前治疗MPP主要药物[6]，其可与细菌核糖体50S结合，从而阻止蛋白质生物合成，治疗MPP的疗效肯定。为此本研究分别予阿奇霉素、地塞米松和阿奇霉素+地塞米松干预，观察在大环内酯类抗生素基础上加用糖皮质激素治疗MPP的疗效。

目前，重症MP感染时使用糖皮质激素仍存在争议，但当MPP患者出现肺不张、肺间质纤维化、支气管扩张或有肺外并发症时可应用糖皮质激素已基本达成共识[7]。地塞米松治疗MPP的效果可能与其免疫调节作用及MP发病的免疫学机制有关。有研究表明，MP感染患者存在 Th1/Th2的失衡，糖皮质激素可选择性抑制Th1介导的细胞免疫，并向Th2介导的体液免疫偏移。糖皮质激素可抑制TNF、IFN和IL-12等炎症介质的产生，减轻炎症反应。本研究结果显示，地塞米松组在治疗后第1和3天肺组织病理学评分显著低于对照组，提示在早期地塞米松对炎症反应有一定抑制作用。

图2 各组大鼠不同时点肺组织病理学改变(苏木精-伊红染色，×100)

Fig 2 Histopathological changes of lung tissue at different time points in different groups(HE staining，×100)

Notes A: Day 1, control group: bronchi were highly infiltrated with massive lymphocytes around them; B: Day 1, azithromycin group: inflammatory cells infiltration in damaged lung tissue with broken alveoli; C: Day 1, dexamethasone group: more lymphocytes infiltration in lung tissue and around blood vessels; D: Day 1, azithromycin+dexamethasone group: more lymphocytes infiltration in lung tissue or around blood vessels; E: Day 3, control group: lymphocytes infiltration in more than 30% bronchi, or around blood vessels; F: Day 3, azithromycin group: lymphocytes infiltration could be still seen around bronchi, accompanied by interrupted infiltration loop; G: Day 3, dexamethasone group: less intrabronchial infiltration; H: Day 3, azithromycin+dexamethasone group: reduced lymphocytes infiltration around bronchioli; I: Day 5, control group: more lymphocytes infiltration around bronchioli and blood vessels; J: Day 5, azithromycin group: reduced lymphocytes infiltration around bronchi and reduced brochial exudation; K: Day 5, dexamethasone group: lymphocytes infiltration and bronchiolitis were still obvious; L: Day 5, azithromycin+dexamethasone group: lymphocytes infiltration around bronchi was reduced and bronchial exudation was almost diasppeared; M: Day 8, control group: lymphocytes infiltration in more than 50% bronchi, or around blood vessels; N: Day 8, azithromycin group: a few lymphocytes infiltration around teminal bronchioli; O: Day 8, dexamethasone group: lymphocytes infiltration around bronchi was slightly reduced, without intrabronchial exudation; P: Day 8, azithromycin+dexamethasone group: slight bronchialitis with a few lymphocytes infiltration around; Q: Day 10, control group: lymphocytes infiltration in more than 50% lung tissue or around blood vessels; R: Day 10, azithromycin group: a few lymphocytes infiltration around less than 25% teminal bronchioli; S: Day 10, dexamethasone group: lymphocytes infiltration around more than 25% bronchioli; T: Day 10, azithromycin+dexamethasone group: lymphocytes infiltration around less than 25% terminal bronchioli

关于糖皮质激素是否可缩短MPP的病程，本研究显示，阿奇霉素组在治疗后第3天，肺组织病理学评分最高，提示肺组织炎症反应处于较严重状态；治疗后第5、8和10天肺组织病理学评分显著降低，也显著低于对照组，提示炎症反应呈减轻趋势。阿奇霉素+地塞米松组在治疗后第3天即可观察到肺组织病理学评分下降，治疗后第5、8和10天肺组织病理学评分进一步下降，且均低于阿奇霉素组；提示在MMP早期大环内酯类抗生素加用地塞米松可降低肺组织的炎症反应，有利于缩短病程。而地塞米松组治疗第1和3天肺组织病理学评分低于对照组，炎症反应有所减轻，但之后肺部炎症反应逐步加重；因其对MP没有直接杀伤作用，单用地塞米松控制MP炎症反应的效果不佳。

结论：在阿奇霉素基础上加用地塞米松可明显减轻MPP大鼠肺组织炎症，并缩短病程。

[1]Principi N, Esposito S.Mycoplasma pneumoniae and Chlamydia pneumoniae cause lower respiratory tract disease in paediatric patients.Curr Opin Infect Dis, 2002,15(3):295-300

[2]Waites KB, Talkington DF.Mycoplasma pneumoniae and its role as a human pathogen.Clin Microbiol Rev,2004,17(4):697-728

[3]Tanaka H, Narita M, Teramoto S, et al.Role of interleukin-18 and T-helper type 1 cytokines in the development of Mycoplasma pneumoniae pneumonia in adults.Chest, 2002,121(5):1493-1497

[4]Lu Q(陆权), Lu M.Epidemiology of Mycoplasma pneumoniae infection.J Appl Clin Pediatr (实用儿科临床杂志)，2007，22(4):241-243

[5]Martin RJ, Chu HW, Honour JM, et al.Airway inflammation and bronchial hyperresponsiveness after Mycoplasma pneumoniae infection in a murine model.Am J Respir Cell Mol Biol, 2001,24(5):577-582

[6]Bébéar CM, Pereyre S.Mechanisms of drug resistance in Mycoplasma pneumoniae.Curr Drug Targets Infect Disord, 2005,5(3):263-271

[7]Miyashita N, Obase Y, Ouchi K, et al.Clinical features of severe Mycoplasma pneumoniae pneumonia in adults admitted to an intensive care unit.J Med Microbiol, 2007,56(Pt 12):1625-1629