陈久艳 顾炳仁

精氨酸为氨基酸类药，现行药品标准采用家兔热原法控制其质量［1］，目前尚未见其细菌内毒素检查的报道。鉴于细菌内毒素检查法具有灵敏快速、简便易行、重现性好等优点，为扩大其应用范围，我们对细菌内毒素检查法应用于精氨酸的质控进行了实验研究，以探讨细菌内毒素检查法取代兔热原检查法用于精氨酸产品质量控制的可行性。

1 实验材料

1.1 试药与试剂 精氨酸:白色粉末，规格:原料药，批号:09021004、09021005、09021006，由苏州东瑞制药有限公司提供。细菌内毒素工作标准品:批号:150601-200861，效价:150 EU·支，由中国药品生物制品检定所提供。鲎试剂:批号:0807260，灵敏度:0.125 EU/ml，由湛江博康海洋生物有限公司生产;批号:0903311，灵敏度:0.125 EU/ml，由湛江安度斯生物有限公司生产，试验前2批鲎试剂的灵敏度复核均符合规定。细菌内毒素检查用稀释剂II(调节供试品的碱性，以下简称稀释剂II):批号:0903160，规格:4 ml/支，内毒素含量小于0.003 EU/ml，由湛江安度斯生物有限公司提供。

1.2 仪器 ZH-2型自动漩涡混合器，由天津药典标准仪器厂生产;DC-3A型细菌内毒素检查干式恒温器，由南京三爱斯技术开发有限公司生产。

2 方法与结果

2.1 精氨酸中细菌内毒素限值的计算 按《中国药典2005年版》［2］规定，细菌内毒素限值(L)由公式 L=K/M计算。其中，K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂K值为5 EU/(kg·h);M为人每公斤体重每小时的最大给药剂量，精氨酸为原料药，根据其制剂盐酸精氨酸注射液临床使用最大剂量换算得到，M值为83 mg/(kg·h)。据此计算，精氨酸的L值为0.06 EU/mg，精氨酸是原料药，考虑之后还有一个制剂生产过程，所以慎重起见，我们最后确定精氨酸的L值为0.01 EU/mg。

2.2 精氨酸稀释度的确定 计算供试品最小有效稀释浓度的公式为C=λ/L(L值为0.01 EU/mg，λ为鲎试剂的标示灵敏度)，当 λ 分别为 0.5 EU/ml、0.25 EU/ml、0.125 EU/ml、0.062 EU/ml、0.031 EU/ml时，则供试品的最小有效稀释浓度 C 应分别为 50 mg/ml、25 mg/ml、12.5 mg/ml、6.2 mg/ml、3.1 mg/ml。

表1 精氨酸最高无干扰浓度实验结果

由表1可见，当供试品溶液浓度≤12.5 mg/ml时，对两个厂家的鲎试剂不产生干扰作用，也就是对λ=0.125 EU/ml以上灵敏度的鲎试剂无干扰。

2.3 干扰试验

2.3.1 干扰试验预实验 试验前验证供试品热原试验均符合规定。为排除供试品溶液对细菌内毒素检查的干扰，求出最高无干扰浓度，先进行干扰试验预实验。将3批精氨酸分别用稀释剂 II配制成 50 mg/ml、25 mg/ml、12.5 mg/ml、6.2 mg/ml、3.1 mg/ml 5个不同浓度的供试品溶液(NPC)，并配制此系列浓度中含2λ的供试品阳性液(PPC)。选择两个厂家的λ为0.125 EU/ml的鲎试剂，分别加入0.1 ml稀释剂II溶解，再分别加入0.1 ml不同浓度的NPC和PPC，混匀后，于37℃保温60 min，同时作阳性对照(PC)和阴性对照(NC)，试验重复2管，结果见表1。

2.3.2 干扰确证试验 为进一步确证供试品溶液对λ为0.125 EU/ml的鲎试剂是否存在干扰作用，用稀释剂II和浓度为0.25 mg/ml的3个批号供试品溶液分别将细菌内毒素工作标准品配制成 0.250、0.125、0.062、0.031 EU/ml4 个浓度的系列内毒素标准溶液。再分别用两个厂家的λ为0.125 EU/ml的鲎试剂实验，同时做供试品溶液的对照，试验重复4管，结果见表2。

由表2可见，内毒素标准溶液的Es值在0.5～2.0λ(包括0.5λ和2λ)范围内，而供试品的Et值则在0.5～2.0 Es(包括0.5Es和2.0 Es)范围内，确证浓度为12.5 mg/ml的3个供试品溶液对λ为0.125 EU/ml鲎试剂无干扰作用。

表2 精氨酸干扰确证试验结果

2.4 精氨酸的细菌内毒素检查 取3个批号的精氨酸，分别用稀释剂II配制成浓度为12.5 mg/ml的供试品溶液，然后用两个厂家的λ为0.125 EU/ml鲎试剂进行细菌内毒素检查，并设供试品阳性(2λ)、PC及NC，结果见表3。

表3 精氨酸的细菌内毒素检查试验结果

由表3可见，3批精氨酸细菌内毒素检查均符合规定。

3 讨论

本实验考察了精氨酸是否对鲎试剂与内毒素的凝聚反应有干扰作用，结果证明将精氨酸按《中国药典》2005年版(二部)附录Ⅺ E中细菌内毒素检查法试验，对鲎试剂与内毒素凝聚反应没有干扰，使用λ为0.125 EU/ml的鲎试剂进行细菌内毒素检查是可行的，确证了细菌内毒素检查法完全可以代替传统的兔热原法用于该制剂的质量控制。据此，提出精氨酸的细菌内毒素检查参考标准:取本品，以能够调节本品的pH值的缓冲液稀释，依照《中国药典》2005年版(二部)附录ⅪE检查，每1 mg精氨酸中含内毒素的量应小于0.01 EU。

［1］国家药典委员会编.中华人民共和国药典(二部).化学工业出版社，2005:831.

［2］国家药典委员会编.中华人民共和国药典(二部).化学工业出版社，2005:附录85.