周书林,赵 磊,赵 涛

2.石家庄市第五医院;

3.皖南医学院附属弋矶山医院生殖医学科

钉螺不同季节及不同螺龄酚氧化酶活力研究*

周书林1,赵 磊2,赵 涛3

目的对钉螺不同季节及不同螺龄酚氧化酶活力进行研究。方法将钉螺分为不同季节组及成、幼螺组。钉螺去壳,取软体组织通过匀浆、离心分别获取粗制酶液,以邻苯二酚为底物用比色法测定各组酶活力,结果进行方差分析。结果不同季节组(春季、夏季、秋季、冬季)钉螺体内酚氧化酶活力差异明显(P＜0.01),分别为 383.32±3.09、271.43±4.16、351.34±2.89、237.37±5.05(U/g)。成、幼螺体内酚氧化酶活力差异明显(P＜0.01),分别为271.43±4.16、473.31±6.13(U/g)。结论钉螺酚氧化酶活力在不同季节及不同螺龄均有差异。

钉螺;酚氧化酶;酶活力

2.石家庄市第五医院;

3.皖南医学院附属弋矶山医院生殖医学科

Email:zhouslokk@yahoo.com.cn

钉螺是日本血吸虫惟一的中间宿主,人们采用各种方法消灭钉螺,以阻断血吸虫病的传播。目前主要有物理、化学及生物灭螺等消灭钉螺的方法,其中应用最多的是化学灭螺〔1〕。酶系统的活性与化学药物的毒性直接相关,多功能氧化酶活性可间接表示药物的毒性程度〔2〕。酚氧化酶(phenol oxidase,PO),作为一种与机体免疫防御等功能密切相关的氧化酶,广泛存在于生物体内〔3〕,但钉螺体内PO相关活性研究报道甚少,本实验中我们对不同季节及不同螺龄钉螺体内酚氧化酶活力进行探讨,为将来以该酶为靶点的新型、高效低毒灭螺制剂的研发提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料 钉螺采自安徽省芜湖市江滩,分别于春季(4月)、夏季(7月)、秋季(10月)冬季(1月)采集4次,以群体逸蚴法,每周逸蚴1次,共逸蚴3次,剔除感染钉螺,选取活力强,螺高为8.6～9.7 mm,螺宽为3.5～4.2 mm的成螺用于不同月份钉螺实验。于7月选取活力强,螺高8.6～9.7 mm,螺宽为3.5～4.2 mm的成螺及螺高3.5～5.5 mm,螺宽1.4～2.4 mm幼螺若干用于成幼螺对比实验。

1.2 主要试剂和仪器 邻苯二酚,分析纯,中国医药集团上海化学试剂公司产品;紫外分光光度计为上海精密科学仪器有限公司产品,型号UV-754;高速冷冻离心机为Hema公司产品;电子天平为日本Shimadzu公司产品;SZ-2自动双蒸纯水蒸馏器为上海沪西分析仪器厂产品;微量移液器(10μ L、100μ L 、200μ L 、1 000μ L)为上海求精生化仪器有限公司产品;电热恒温水浴锅为上海医疗器械五厂产品。

1.3 方法

1.3.1 粗制酶液的制备 按参考文献〔4〕的方法解剖钉螺若干只,剔去螺壳,选取无损伤的软体组织,并称重。按重量体积1∶5的比例,即1 g组织加入5 mL预冷的0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH 6.8),冰浴匀浆,4℃静置30 min,4℃、8 000 r/min离心30 min,取上清液即为粗制酶液。

1.3.2 酶活力测定方法 参照Benjamin和Montgomery〔5〕的方法并略有改进:采用磷酸钠盐缓冲体系,在3 mL的测活体系(包含浓度为0.2 mol/L、pH 6.8 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液和16 mmol/L邻苯二酚)中加入30 μ L酶液,28℃下检测430 nm下光密度(OD)值,绘制OD值随时间的增长直线,从直线斜率求得酶活力。酶活力单位(U)定义为以每分钟催化底物氧化增加OD值为0.001。PO酶量以每克体重所含的酶活力单位数(U/g)表示〔6〕。上述步骤各组重复3次,每次重新制备酶液。

1.3.3 不同季节成螺酚氧化酶活力测定 分别选取春季(4月)、夏季(7月)、秋季(10月)冬季(1月)采集的成螺若干只,按上述方法提取酶液,置于-40℃超低温冰箱冻干保存,待酶液全部收集完毕,于28℃下检测430 nm单位时间OD变化值。比较不同季节成螺酚氧化酶活力变化情况。

1.3.4 成、幼螺酚氧化酶活力测定 分别选取成、幼螺若干只,按上述方法测定单位时间OD变化值,观察成、幼螺酚氧化酶活力变化情况。

1.3.5 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件处理实验数据,多组间均数比较采用方差分析,两组间均数比较用SNK-q检验。

2 结 果

2.1 不同季节钉螺酚氧化酶活力春季(4月)、夏季(7月)、秋季(10月)冬季(1月)酚氧化酶含量(U/g)分别为 383.32±3.09、271.43±4.16、351.34±2.89、237.37±5.05。结果表明:不同季节钉螺酚氧化酶的活力有显著性差异(F=909.71,P＜0.01),各组之间比较有显著性差异(P＜0.01),以春季酚氧化酶活力最高,冬季活力最低(图1)。

2.2 成、幼螺酚氧化酶活力 分别测定成、幼螺酚氧化酶的活力,结果成、幼螺酚氧化酶含量(U/g)分别为271.43±4.16、473.31±6.13。结果表明成、幼螺酚氧化酶的活力差异明显(t=47.31,P＜0.01),成螺酚氧化酶活力低于幼螺。

3 讨 论

图1 不同季节钉螺PO活力的变化Fig.1 Changes on PO activity of Oncomelania snails in different seasons

本实验研究表明,钉螺体内PO在春秋季活力最高,夏季次之,冬季 PO活力最低,这与杨坤〔7〕等发现钉螺体内NOS、SDH等酶活力随温度的增高,其酶活力增强基本一致。PO主要通过产生黑色素来杀死入侵的微生物,在无脊椎动物体液免疫中起着重要的作用〔8〕。另外PO还参与醌鞣化作用,促进其表皮的硬化与黑化,在无脊椎动物防御反应中起到重要作用〔8〕。温度能严重影响钉螺的生活与活动,适宜钉螺生活的温度是20～25℃,过冷和过热均不利于钉螺的活动〔2〕。由此我们推测,钉螺在春秋季节活动性较强,与外界环境接触机会较多,亦通过体内合成大量PO,来抵御外界微生物的入侵。而夏、冬季节,钉螺多处于夏蛰和冬眠状态,极少开厣活动,从而降低了体内酶的代谢,减少了与外界环境的接触,这亦可能是体内PO减少的原因。

PO还通过硬化反应来硬化角质,它是唯一参与角质硬化的酶。硬化对昆虫的成活非常重要的,它为柔软的无脊椎动物身体提供保护。在硬化过程中,PO产生的醌与角蛋白及甲壳质相互作用,最终交联形成角质,高度硬化的角质能阻断微生物和异物的入侵。本研究我们发现,钉螺随着螺龄的增长,其体内PO活力逐渐降低,这一结果与不同日龄埃及伊蚊和不同龄期斯氏按蚊中PO活力变化随蚊龄增加酶活力降低的研究结果一致〔8-9〕,而与菜青虫和马尾松毛虫的PO研究结果基本相反〔10-11〕。不同螺龄体内PO的变化,可能是因为低龄幼螺的体壁较薄,不易抵抗病菌的入侵,高活力的PO能提高幼螺的免疫力,而且随着钉螺螺龄的增加,螺壳的硬化,以及体壁的增厚及黑化,都可能需要PO的参与。然而成螺螺壳发育基本完成,体壁亦也增厚、黑化,抵御外界病菌的能力较强,因此其PO活力降低。

〔1〕毕研云,图立红,李枢强,等.我国常用的灭螺方法〔J〕.生物学通报,2006,41(11):17-18.

〔2〕周晓农.实用钉螺学〔M〕.北京:科学出版社,2005:94-115.

〔3〕蔡国斌,何立,蒋明森.寄生虫酚氧化酶的研究进展〔J〕.中国寄生虫病防治杂志,2004,17(3):184-191.

〔4〕李赋京.钉螺的解剖和比较解剖〔M〕.武汉:湖北人民出版社,1956:1-20.

〔5〕Benjamin ND,Montgomery MW.Polyphenol oxidase ofRoyal Ann cherries:purification and characterization〔J〕.J Food Sci,1973,38(5):799-806.

〔6〕 Fetterer RH,Hill DE.The occurrence of phenol oxidase activity in femaleTrichuris suis〔J〕.J Parasitol,1993,79(2):155-159.

〔7〕杨坤,周晓农,梁幼生,等.冬季温度变化对钉螺一氧化氮合酶的影响〔J〕.中国血吸虫病防治杂志,2003,15(2):93-97.

〔8〕时超美,黄复生,况明书,等.斯氏按蚊血淋巴酚氧化酶与约氏疟原虫卵囊黑化的关系〔J〕.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2001,18(1):11-13.

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〔11〕陈尚文,杨振德.马尾松毛虫和荔蝽体内多酚氧化酶的初步研究〔J〕.广西科学,1996,3(2):45-50.

Phenol oxidase activity ofOncomelaniasnails in different ages and seasons

ZHOU Shu-lin,ZHAO Lei,ZHAO Tao
(Department of Parasitology,Wannan Medical College,Wuhu241002,China)

In order to study the phenol oxidase(PO)activity ofOncomelaniasnails in different ages and seasons,snails were divided into groups and crude enzyme was obtained through homogenation and centrifugation.By using colorimetric method with catechol as substrate,PO activities of these groups were detected and results were compared by variance analysis.There were significant differences among PO activities in different seasons(spring,summer,autumn and winter)with the results of 383.32±3.09,271.43±4.16,351.34±2.89,and 237.37±5.05(U/g),respectively(P＜0.01).There were also significant differences in the activity of PO between two age groups with the results of 271.43±4.16 and 473.31±6.13(U/g),respectively(P＜0.01).It's suggested that there are significant differences among the activity of PO in different seasons and ages.

Oncomelaniasnails;phenol oxidase;enzyme activity

R383.2

A

1002-2694(2010)09-0856-02

*安徽省教育自然科学基金(kj2009B152)和皖南医学院中青年科研基金(wk200710)

1.皖南医学院医学寄生虫学教研室,芜湖 241002;

2010-01-15;

2010-06-22