蒋就喜,房修罗,沈继龙,胡婷婷

2.安徽医科大学微生物与寄生虫学教研室,合肥230032;

日本血吸虫rSj14-3-3疫苗和rSj26GST疫苗联合免疫保护作用研究*

蒋就喜1,房修罗1,沈继龙2,胡婷婷1

目的观察日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)疫苗和重组M r2600谷胱甘肽S转移酶(rSj26GST)疫苗联合免疫对小鼠的保护作用。方法将含有Sj14-3-3和S j26GST编码基因的菌株E.coliBL21/p ET28a涂布LB/Kana/IPTG/X-gal平板,培养、收集细菌、超声碎菌、分离、纯化,分别取5μ L进行SDS-PAGE,观察纯化结果,采用 BCA法测定重组蛋白的浓度。联合免疫组BALB/c小鼠分别在第0、2、4周用 rSj14-3-3疫苗 rSj26GST疫苗联合免疫;而单独免疫的 rSj14-3-3组及rSj26GST组,与上组同步各自免疫3次。末次免疫后2周进行感染攻击,45d后剖杀,计数成虫及肝内虫卵。同时设PBS对照组。计算各组间的减虫率和减卵率,以及虫卵肉芽肿的大小。结果联合免疫组的减虫率为38.38%,显著高于rSj14-3-3(16.98%)和rSj26GST组(26.80%)(P＜0.01)。联合免疫组以及 rSj14-3-3、rSj26GST组减卵率分别为48.81%、25.27%、41.41%;联合免疫组 rSj14-3-3和 rSj26GST组 ,肝组织中每条雌虫平均产卵数显著低于 PBS对照组(P＜0.01)。联合组小鼠虫卵肉芽肿的直径为(173.9±35.0μ m),显著小于对照组(267.7±28.6μ m)(P＜0.01),联合组亦明显低于rSj14-3-3和rSj26GST组(P＜0.01)。结论联合免疫组的保护作用优于rSj14-3-3和rSj26GST单独免疫组。且联合免疫疫苗具有一定的抗虫卵肉芽肿及抗肝纤维化作用。

日本血吸虫;信号蛋白14-3-3;谷胱甘肽 S转移酶;重组蛋白;联合免疫

2.安徽医科大学微生物与寄生虫学教研室,合肥230032;

Email:gljiangjx@sohu.com

血吸虫病是由复殖寄生吸虫引起的以虫卵肉芽肿和肝纤维化为主要特征的免疫性疾病,世界卫生组织(WHO)将其列为仅次于疟疾的一种重要热带病。该病曾在全球76个国家和地区流行,共约2亿血吸虫病患者,6亿人健康受威胁;仅我国还尚有448个血吸虫病流行县(市、区),共有33 810个流行村,估计患者67万人〔1〕。国内外防治血吸虫病的主要策略是:采取人畜同步化疗、易感地带灭螺、环境改造以及健康教育等相结合的综合性防治措施,但面临如成本高、防治效果欠理想、治愈病人再感染严重、血吸虫虫株耐药性出现的潜在威胁等问题。因此研制血吸虫病疫苗可作为化疗的补充,能更有效地控制血吸虫感染。

一般认为,虫荷降低50%即可明显减轻机体的病理损害和降低患病率,并且还可以减少流行〔2〕,但是仅靠获得的其中一种血吸虫疫苗候选分子在动物模型体内产生的免疫保护力大部分未达WHO所提出的预期目标≥40%减虫率,如用rSj14-3-3免疫BALB/c小鼠可获得34.2%的减虫率和50.74%的减卵率〔3〕,刘述先等〔4〕等用 rSj26kDaGST 进行免疫小鼠,获得24%～32%的减虫率,57%～79%的减卵率,肝脏肉芽肿显著减小。许多研究为了提高血吸虫疫苗的免疫保护效果,他们试图采用联合免疫方案,将不同靶的、不同来源的疫苗通过不同的方式联合应用〔5-6〕。本研究用日本血吸虫rSj14-3-3疫苗和重组蛋白(rSj26GST)疫苗联合免疫小鼠,探讨其协同保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 阳性钉螺 含尾蚴的阳性钉螺购自江西省血吸虫病防治研究所。

1.1.2 实验动物 实验动物系无特定病原体(specific pathogen free,SPF)6～8周龄雌性BALB/c小鼠60只,体重16～18g,购自安徽医科大学实验动物中心。

1.1.3 抗原(菌株) 表达重组抗原Sj14-3-3和Sj26GST编码基因的菌株E.coliBL21/p ET28a由安徽医科大学馈赠。

1.1.4 试剂 rSj14-3-3和rSj26GST蛋白纯化试剂盒 His◦Band Purification Kit购至Novagen公司。卡那霉素、SDS、低分子量蛋白质Marker、Tris碱等均为华美公司产品。低分子量蛋白质Marker购自北京全式金生物技术有限公司。BCA试剂盒购自碧云天公司。福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂均为美国Sigma公司产品。

1.2 rSj14-3-3和rSj26GST的制备和纯化 含有rSj14-3-3和rSj26GST编码基因的菌株E.coliBL21/pET28a分别涂布于LB/Kana/IPTG/X-gal平板,37℃培养过夜。挑取单个白色阳性菌落,分别置以含Kana的LB培养基37℃,225 r/min振荡培养过夜,按1∶50比例接种 LB/Kana培养基,培养至OD600约为0.6,取出1mL作为诱导前对照,加入IPTG至终浓度为1mmol/L继续培养诱导表达,分别取诱导后 1、3、5、7h 菌液进行 SDS-PAGE确定最佳诱导时间为5h。再次取表达rSj14-3-3和rSj26GST菌进行摇菌收集诱导5h后的菌液,于4℃,4 000r/min离心集菌,以PBS重悬沉淀。将重悬菌液置冰水浴中在380W功率下超声粉碎,超声3s,间歇3s,60次1个循环,每个循环间歇10 min,共4个循环。将超声破碎后的表达产物于4℃,10 000 r/min离心10 min,取上清按His◦Band Purification Kit说明书,用6×His亲和层析柱纯化表达产物(rSj14-3-3和rSj26GST),最后洗脱时分组(1.0 ml/组)收集洗脱液,分别 5μ L进行 SDSPAGE,观察纯化结果。采用BCA法测定重组蛋白的浓度。

1.3 动物保护性试验

1.3.1 免疫 60只6～8周龄BALB/c雌性小鼠随机分为 A 、B、C、D4组,每组15只。A 组(PBS对照组),于第0周每鼠经背部皮下多点注射50μ L PBS及等体积福氏完全佐剂(CFA),第2及4周每鼠皮下多点加强注射50μ L PBS加等体积福氏不完全佐剂(IFA)。B组(rSj14-3-3组)和 C组(rSj26GST组),同 A 组,唯将 PBS改为 50μ g(50μ L)rSj14-3-3和 rSj26GST。D 组(rSj14-3-3+rSj26 GST联合免疫组),于第 0及第 2、4周经背部皮下多点注射 rSj14-3-3和 rSj26GST各50μ g及等体积CFA。

1.3.2 攻击感染 末次免疫后4周,每鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(30±2)条,45 d后剖杀,门静脉灌注法收集成虫,计算减虫率。取小鼠肝脏,称重,加5%KOH 20mL,于37℃消化过夜,取0.1mL计数虫卵,计算每条雌虫在肝组织中的减虫率和减卵率:减虫率 =(对照组每鼠平均成虫数-实验组每鼠平均成虫数)/对照组每鼠平均成虫数×100%减卵率 =(对照组每雌虫平均产卵数-实验组每雌虫平均产卵数)/对照组每雌虫平均产卵数×100%

1.4 各组小鼠血吸虫病肝组织HE染色 每组取出7只感染后小鼠肝组织,经10%甲醛固定,石蜡包埋、制作5μ m厚的连续石蜡切片,HE染色、封片,用以测量虫卵肉芽肿大小。

1.5 单卵肉芽肿大小的测量方法 肝组织HE染色后,用目镜十字测微尺每组观察测量20个内含完整毛蚴的单虫卵肉芽肿的垂直相交的最大纵径(B)和最大横径(A),以最长径加最宽径的和除以2为肉芽肿平均直径。目镜测微器1格=0.15mm。按文献〔7〕方法计算虫卵肉芽肿面积:A=Л AB/4,体积:V=Л AB2/6。

1.6 采用SPSS14软件进行t检验分析。

2 结 果

2.1 rSj14-3-3诱导表达产物的SDS-PAGE分析分别将含有 rSj14-3-3的BL21/pET28a菌诱导表达前和诱导后1、3、5、7h取样,用1×SDS-PAGE上样缓冲液处理,取10μ L上样液进行 SDS-PAGE电泳。结果如图1所示:在30.0 kDa～40.0 kDa蛋白条带之间靠近30.0 kDa处,可见特异蛋白随着诱导时间的增加表达量也逐渐增加,由于融合蛋白含有6 His-tag,重组蛋白分子量大小约为33 kDa,与理论值相符。

图1 rSj14-3-3诱导表达产物的SDS-PAGE分析Fig.1 Analysis of purified rSj14-3-3 by SDS-PAGE

2.2 rSjGST诱导表达产物的SDS-PAGE分析分别将含有rSjGST的BL21/pET28a菌诱导表达前和诱导后 1、3、5、7h取样,用1×SDS-PAGE 上样缓冲液处理,取 10μ L上样液进行SDS-PAGE电泳。结果如图2所示:在20.0kDa～30.0kDa蛋白条带之间靠近30.0kDa处,可见特异蛋白的表达,由于融合蛋白含有6His-tag,重组蛋白分子量大小约为26kDa,与理论值相符。

图2 rSjGST诱导表达产物的 SDS-PAGE分析Fig.2 Analysis of purified rSjGST by SDS-PAGE

2.3 rSj14-3-3和rSjGST诱导表达纯化产物的SDS-PAGE分析 分别将含有rSj14-3-3和rSjGST的BL21/pET28a菌诱导表达并纯化,以空菌株E.coliBL21、诱导前、诱导后5h为对照,用1×SDS-PAGE上样缓冲液处理,取5μ L上样液进行SDS-PAGE电泳。结果如图3。从泳道4、5可见约26 kDa处,可见纯化后的清晰单一的 rSjGST蛋白条带,从泳道7、8可见约33 kDa处,可见纯化后的清晰单一的rSj14-3-3蛋白条带。BCA法测定rSjGST蛋白浓度为1.12g/L和rSj14-3-3蛋白浓度为2.03g/L。M:protein marker;1:p ET28a/BL21;2:rSj14-3-3/p ET28a/BL21 uninduced with IPTG;3:expression of rSjGST,5h after IPTG induction;4-5:purified rSjGST;6:expression of rSj14-3-3,5h after IPTG induction;7-8:purified rSj14-3-3

图3 纯化后的rSj14-3-3和rSjGST蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 Analysis of purified rSj14-3-3 and rSjGST by SDS-PAGE

2.4 免疫保护效果

2.4.1 减虫率 攻击感染后45d剖杀小鼠,各组获得的虫荷及减虫率见表1。经t检验分析,rSj14-3-3和rSj26GST联合免疫组的虫荷明显低于rSj14-3-3或rSj26GST单独免疫组(P＜0.05);rSj14-3-3和rSj26GST单独免疫组之间虫荷差异无显著性(P＞0.05)。

2.4.2 减卵率 各组小鼠肝组织中每条雌虫平均产卵数及减卵率见表2。联合免疫组及单独免疫组每条雌虫平均产卵数低于对照组,差异显著(P＜0.05);各单独免疫组之间比较,每条雌虫平均产卵数差异无显著性(P＞0.05)。

表1 每组平均检获的成虫比较Table 1 Comparison of average recovered adult worms between groups

表2 各组每鼠肝脏虫卵数比较Table 2 Comparison of hepatic eggs per mice between groups

2.5 肝虫卵肉芽肿大小的比较 联合组、单独rSj14-3-3组、单独rSj26GST组与对照组比较,肝组织单卵肉芽肿平均直径、面积、体积都不同程度的减少,联合组和单独rSj26GST减少更多,但以联合组减少的最显著。联合组卵肉芽肿平均直径、面积、体积的减少率分别达35.01%、56.62%、70.46%。联合组与单独 rSj14-3-3组比较差别也有统计学意义。

表3 每组肝虫卵肉芽肿大小的比较Table 3 Comparison the size of hepatic egg granuloma per mice between groups

3 讨 论

本实验用rSj14-3-3和 rSj26 GST联合免疫BALB/c小鼠,获得了38.18%的减虫率,与rSj14-3-3单独免疫(减虫率为16.98%)和rSj26GST单独免疫(减虫率为 26.81%)相比,差异显著(P＜0.05)。表明 rSj14-3-3和 rSj26GST蛋白疫苗联合应用能提高免疫效果。通过计算小鼠肝组织减卵率得到联合组从25.27%和41.41%显著提到48.81%,而且均低于对照组,进一步说明疫苗组具有抗血吸虫感染作用外,还有一定的抗生殖能力。14-3-3蛋白质是广泛存在于植物、酵母、原虫、蠕虫、昆虫和包括人类在内的多种哺乳动物真核细胞内的一组多功能酸性蛋白质,分子量约为 30kDa,在1967年Moore等人研究脑蛋白系统分类时被发现。在寄生生物中,14-3-3也是维持细胞周期和虫体生殖发育的主要信号转导分子〔8〕。血吸虫在长期的寄生生活演化过程中,虫体内某些高度保守的功能基因及其表达产物在细胞间、细胞内的信号转导及细胞功能调节中发挥重要作用〔9〕,现已知14-3-3蛋白质是一组高度保守的多功能蛋白质,是细胞内信号转导的中枢调节因子,在细胞发育、增殖、分化、凋亡及免疫应答刺激阶段都起着重要的作用〔10-11〕,因此可以通过14-3-3蛋白干预细胞信号转导途径而影响虫体细胞快速增殖或增强细胞对凋亡的敏感性。rSj26GST疫苗针对血吸虫的谷胱甘肽S转移酶,从而干扰了血吸虫谷胱甘肽S转移酶的解毒功能。蛋白疫苗能诱导较强的体液免疫反应 ,但其诱导的细胞免疫反应常显不足。这两种疫苗的作用靶不同,似可产生互补体液免疫反应作用,故这两者的联合应用可产生一定的协同或增强作用。

联合组小鼠虫卵肉芽肿的直径为(173.9μ m±35.0μ m),显著小于对照组的(267.7μ m ±28.6μ m)(P＜0.01),联合组亦明显低于rSj14-3-3和rSj26 GST组(P＜0.01),表明联合免疫疫苗具有一定的抗虫卵肉芽肿及抗肝纤维化作用。血吸虫病是一种以沉积于感染宿主肝、肠组织内虫卵引起的肉芽肿及其纤维化为主要病变特征的免疫性疾病。成熟血吸虫虫卵释出的可溶性抗原致敏T淋巴细胞使之释放细胞因子,引起以淋巴细胞、嗜酸粒细胞、巨噬细胞、成纤维母细胞、中性粒细胞等聚集的肉芽肿反应。虫卵肉芽肿的形成是宿主对血吸虫致病因子的一种免疫应答反应。一方面,通过肉芽肿的形成将虫卵包围,以隔离和清除虫卵释出的抗原及毒素,避免对宿主组织的损害;另一方面,肉芽肿反应破坏了宿主正常的组织结构,不断生成的虫卵肉芽肿逐步纤维化而形成相互连接的疤痕,导致肝硬化、门脉高压等严重的并发症。日本血吸虫虫卵肉芽肿的大小与堆积的虫卵数量有关,虫卵数量愈多,肉芽肿体积愈大,病变也愈严重。

目前国内外科研人员对有潜力的血吸虫疫苗候选抗原进行研究,如陈家旭等研究副肌球蛋白(paramyosin 97)Sjc97DNA核酸疫苗具有一定的抗虫卵肉芽肿及抗肝纤维化作用〔12〕;用脂肪酸结合蛋白(SjFABP)免疫小鼠可获得34%～49%的减虫率,免疫大鼠和羊可获得32%～59%的减虫率〔13〕;用重组磷酸丙糖异构酶(Triose phosphate isomerase,TPI)TPI免疫不同种的小鼠,攻击感染后小鼠减虫率为 21.4%～ 27.8%〔14〕膜蛋白(Integral membrane protein)可作为宿主的免疫攻击目标,能诱导宿主产生特异性IgE和IgA抗体,并有一定的抗血吸虫感染能力〔15〕;但是从目前血吸虫疫苗研究的成果来看,仅靠获得的其中一种血吸虫疫苗候选分子在动物模型体内产生的免疫保护力大部分未达到WHO所提出的预期目标。

国内外也有对运用联合疫苗进行免疫的研究,如将日本血吸虫SjTPI和SjC23DNA疫苗联合免疫可提高保护力〔16〕;用rSj26 GST DNA 疫苗和重组蛋白疫苗联合免疫小鼠,结果联合组的减虫率为50.8%,显著高于单独组〔17〕;他们都是运用重组蛋白疫苗和DNA疫苗进行联合免疫,通过蛋白免疫产生的体液免疫和DNA疫苗产生的细胞免疫对宿主产生协同作用。但本实验是使用两种不同的重组蛋白进行免疫,通过两种不同的作用靶点,它们似可产生互补体液免疫反应,可产生一定的协同或增强作用。

本研究结果表明,用重组蛋白 rSj26GST和rSj14-3-3联合免疫小鼠,有一定协同作用,可增强其免疫保护作用,其作用机制有待进一步探讨。且本实验结果是疫苗免疫攻击感染小鼠6周时的结果,其远期效果如何需进一步研究。

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Protective efficacy of co-immunization with rSj14-3-3 and rSj26 GST vaccines againstSchistosoma japonicumin mice

JIANG Jiu-xi,FANG Xiu-luo,SHEN Ji-long,HU Ting-ting
(Infectious Diseases Section of Af f iliated Hospital,Guilin Medical College,Guilin541001,China)

To study the protective efficacy of co-immunization with recombinantSj14-3-3(rSj14-3-3)and recombinantSj26 protein(rSj26GST)vaccines againstSchistosoma japonicumin BALB/c mice,the LB/Kana/IPTG/X-gal plate was coated byE.coliBL21/pET28a strains which contained rSj14-3-3 and rSj26GST coding genes.The bacteria were then cultured,collected,smashed,separated and purified progressively.The results of SDS-PAGE purified proteins were observed and the concentration of recombinant proteins was determined by BCA.Mice in co-immunization group were co-immunized with rSj14-3-3 and rSj26GST vaccines at week 0,week 2 and week 4.While mice in rSj14-3-3 group and rSj26GST group were respectively immunized with rSj14-3-3 and rSj26GST vaccines in synchrony with co-immunization group.Two weeks after last immunization,mice were challenged by 30±2 cercariae ofS.japonicum(Chinese strain).On day 45 post-infection,mice were sacrificed and the number of worms and eggs in liver tissue was counted.The PBS control group was set and the worm reduction rate and egg reduction rate were counted.Results revealed that the worm reduction rate in co-immunized group was 38.4%,significantly higher than that in rSj14-3-3 group(17.0%,P＜0.05)and rSj26GST group(26.8%,P＜0.05).Liver egg reduction rate in co-immunized group,rSj14-3-3 group and rSj26GST group were 48.8%,25.3%and 41.4%,respectively.The average number of oviposition for female in liver of co-immunized mice was significantly lower than that in the control group(P＜0.01).The mean hepatic egg granuloma diameter of co-immunized group(173.9±35.0μ m)was significantly smaller than that of control group(267.7±28.6μ m)(P＜0.01).In addition,the diameter of co-immunized group was also smaller than that of rSj14-3-3 group(240.8 ±44.3μ m)and rSj26 GST group(191.6±26.3μ m)(P＜0.05).It's supposed that compared with the immunization of rSj14-3-3 or rSj26GST alone,the coimmunization with rSj14-3-3 andSj26GST could enhance pro-tective efficacy in BALB/c mice.Furthermore,co-immunized vaccine might act as an effective inhibitor against formation of egg granuloma and reduce immunopathological damage caused bySchistosoma japonicumin the host.

Schistosoma japonicum;rSj14-3-3;Sj26GST;recombinant protein vaccine;co-immunization

R532.2

A

1002-2694(2010)09-0825-05

*广西自然科学基金(桂科自0728236)

1.桂林医学院附属医院感染性疾病科,桂林 541001;

2009-09-22;

2010-01-27