王淑玲,宋春花,段广才,张卫东,郗园林,朱静媛

志贺菌耐多药相关基因水平转移的验证及其耐药性研究*

王淑玲,宋春花,段广才,张卫东,郗园林,朱静媛

目的对志贺菌耐多药相关基因(T1C4)水平转移进行验证,并对其与细菌耐药性的关系进行初步判定。方法培养已筛选出的包含T1C4基因片段的阳性克隆,提取其质粒,PCR扩增T1C4基因片段、纯化、制备探针,与志贺菌敏感株SS23、志贺菌耐多药转移株(ST11)、大肠埃希菌耐多药株(E667)的基因组DNA和质粒DNA进行斑点杂交。采用药敏纸片法研究含T1C4基因片段大肠埃希菌的耐药性。结果应用PCR方法可以从ST11和E667菌株基因组DNA中扩增出T1C4基因片段,而SS23菌株不含该基因片段;应用T1C4基因探针进行斑点杂交显示,ST11和E667菌株的全基因组和质粒DNA均可显示杂交信号,而SS23菌株的基因组和质粒DNA均不产生杂交信号;14种药物的药敏试验表明,含有T1C4基因的大肠埃希菌(DH5α)对四环素、先锋V、头孢噻吩、氟哌酸、复方新诺明等五种药物的抑菌环直径明显小于(相差 3mm以上)不含T1C4基因的DH5α菌株。结论T1C4基因片段为ST11菌株从E667菌株获得,且存在于两菌株的质粒上;T1C4基因可能介导细菌对多种药物的抗性。

志贺菌;耐多药;基因水平转移

细菌可通过自身基因突变和耐药基因的获得2种途径产生耐药性〔1〕,并且外源性耐药基因的获得,即耐药基因的水平转移,是临床耐药菌株产生的主要途径之一〔2〕。为了系统研究耐药基因的水平转移,本课题组利用临床分离的大肠埃希菌耐多药株(E667)作为供体菌,志贺菌敏感株(以下简称敏感株或SS23)作为受体菌,经实验室液体接合试验,成功获得了一株志贺菌耐多药转移株(以下简称转移株或ST11);通过敏感株和转移株基因组DNA抑制性消减杂交文库的构建以及筛选和鉴定,获得了多个可能与耐多药相关的基因片段〔3〕。本文对已筛选出的一个未知功能的基因片段(T1C4)在基因组上的位置进行确定,并对其与细菌耐药性的关系进行初步研究。结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集河南省郑州市郑州大学附属医院腹泻患者粪便培养细菌标本,在就诊医院鉴定后,送本实验室重新进行生化和血清学鉴定。然后对收集的临床分离志贺菌及大肠埃希菌进行筛选,用头孢噻吩、诺氟沙星、庆大霉素、磺胺甲基异恶唑四种抗生素采用Kirby-Bauer纸片琼脂扩散法进行药敏试验。大肠埃希菌耐多药株(E667):对上述四种抗生素均耐药,分离自郑州大学一附院;志贺菌敏感株(SS23):对上述四种抗生素均敏感,分离自郑州大学三附院;志贺菌耐多药转移株(ST11):由E667作为供体菌,SS23作为受体菌进行液体接合试验,在上述四种抗生素选择压力下获得〔3〕。

1.2 试剂 细菌基因组DNA提取试剂盒及琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京天根试剂公司),DNA标记检测试剂盒(德国ROCHE公司),限制性内切酶HinfI(日本TAKARA生物公司),PCR相关试剂(北京天根生物公司),MH培养基(北京陆桥技术公司),14种抗生素纸片:先锋V(Cefazolin)、头孢噻吩(Cefalotin)、先锋噻肟(Claforan)、庆大霉素(Gentamycin)、链霉素(Streptomycin)、妥布霉素(Tobramycin)、四环素(Tetrocycline)、环丙沙星(Ciprofloxacin)、左氧氟沙星(Levofloxacin)、诺氟沙星(氟哌酸)(Norfloxacin)、奈啶酸(Nalidixic acid)、氯霉素(Chloramphenicol)、复方新诺明(SMZ-TMP)、呋喃妥因(Nitrofurantoin)产自杭州天和微生物试剂公司。

1.3 引物 引物由北京赛百胜生物公司合成,第一轮PCR引物为巢式PCR的外侧引物:N1:5′-TCG AGC GGC CGC CCG GGC AGGT-3′和 N2R:5′-AGC GTG GTC GCG GCC GAG GT-3′,扩增产物是T1C4基因片段。第二轮PCR所用引物根据本实验室已经测得的T1C4序列,利用PRIMER 5.0软件自行设计;P1∶5′-GGG CAG GTA CAC NNN NNN AAA CAC T-3′;P2:5′-GCATCT GCT NNN NNN TGG T TT G-3′;其扩增产物为 T1C4的中间序列。

1.4 方法

1.4.1 质粒DNA及全基因组DNA提取 菌株培养根据参考文献进行〔4〕;采用碱裂解小量提取质粒DNA法获得菌株质粒DNA,具体步骤按照分子克隆第3版进行〔5〕;细菌全基因组DNA的提取利用细菌基因组DNA提取试剂盒完成。提取后的质粒DNA(基因组 DNA)各取 3μ L,用 1%琼脂糖凝胶5V/cm电压电泳35min,0.5μ g/mL溴化乙锭染色,紫外灯下观察结果。核酸相对分子质量标准为DL2000 DNA Marker。

1.4.2 聚合酶链反应(PCR) 第一轮 PCR在25μ L体系中进行,反应体系参照文献混合〔6〕。反应条件:94℃预变性5 min,PCR循环参数参照文献〔7〕完成。

第二轮PCR在50μ L体系中进行,模板为第一轮PCR产物,反应体系详见参考文献〔8〕。反应条件94℃预变性5 min,PCR循环参数为:94℃30s,61℃30s,72℃60s,共32个循环,最后 72℃延伸10min。各取第一轮和第二轮PCR产物5μ L,用1.5%琼脂糖5V/cm电压电泳30min,0.5μ g/mL溴化乙锭染色,紫外灯下观察结果。核酸相对分子质量标准为DL2000 DNA Marker。

1.4.3Hinf I酶切鉴定阳性克隆 对第二轮PCR产物Hinf I内切酶酶切鉴定。具体操作过程按照文献〔9〕和内切酶Hinf I说明书完成。

1.4.4 探针标记与斑点杂交 将第二轮PCR扩增的基因产物利用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化后(具体步骤根据该试剂盒说明书完成),采用随机引物法地高辛标记作为T1C4基因片段的探针。检测探针的标记效率〔10〕,根据标记的效率选择合适的探针浓度。取菌株 E667、SS23、ST11的质粒和基因组DNA各2μ L,100℃变性 10min,迅速置冰中5min,将变性后的DNA点在尼龙膜上,在含有探针的杂交液中杂交,应用地高辛试剂盒检测杂交结果。具体操作步骤根据文献〔10-11〕完成。

1.4.5 药敏试验 采用WHO推荐的改良Kirby-Bauer纸片,其结果判定参照卫生部制定的《纸片法抗菌药物敏感试验标准》(WS/T125-1999),质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922株(购自中国药品生物制品检定所)。为保证结果的可靠性,每个菌株对同一种抗生素的耐药性实验在相同条件下重复两次。

2 结 果

2.1 PCR扩增及产物的琼脂糖电泳 分别以E667、SS23、ST11基因组 DNA 为模板,应用N1和N2R引物进行第一轮PCR扩增,结果E667、ST11均可扩增出T1C4基因片段全序列,长度805bp(见图1-A),而SS23扩增不出这一片段。分别以上述扩增出的DNA片段为模板,应用P1和P2引物进行第二轮PCR扩增,均可产生长度671bp的片段(见图1-B),与预期结果一致。

图1 PCR扩增产物的电泳结果Fig.1 PCR amplified analysis of gene T1C4

2.2 PCR产物的酶切检定 根据已知序列分析,第二轮PCR扩增产物经Hinf I酶切后,应产生281bp和390bp两条片段,电泳结果与预期一致(见图2)。

图2 第二轮PCR扩增产物的Hinf I酶切电泳M:DL 2000 DNA marker;Q:酶切产物;W:第二轮PCR扩增产物Fig.2 Analysis of the 2ndPCR amplified products digestedwith Hinf IM,DL 2000 DNA marker;Q:2ndPCR amplified products digested with Hinf I;W:2ndPCR amplified products

2.3 T1C4探针与待检测DNA斑点杂交 应用已标记的T1C4基因探针分别与 E667、SS23、ST11的基因组DNA和质粒 DNA进行杂交,结果E667、ST11的基因组DNA和质粒DNA均可产生杂交信号,而与SS23的基因组DNA和质粒均没有杂交信号,见图 3。这一结果说明E667和ST11均含有T1C4,且这一基因片段位于两菌株的质粒上。

2.4 细菌药敏试验 应用14种抗生素对大肠埃希菌 DH5α、DH5α(pUC18)、DH5α(pUC18-T1C4)菌株进行药敏试验,结果见表 1。从表1可以看出,DH5α(pUC18-T1C4)菌株对四环素、先锋 V、氯霉素、头孢噻吩、氟哌酸、复方新诺明等六种抗生素的抑菌环直径明显小于DH5α、DH5α(pUC18)。

图3 探针与待检测DNA的斑点杂交Fig.3 Dot bolt hybridization with T1C4 gene probe

表1 菌株药敏试验

3 讨 论

基因水平转移研究是研究基因的结构与功能的重要工具,通过研究不仅可以发现哪些基因可以发生水平转移,而且还能发现该基因在微生物群落中的行为表现。尽管点突变可以影响细菌菌株的毒力表型,但是通过水平转移获取毒力基因在病原菌的进化过程中更为普遍〔12〕。因此,基因水平转移研究可使我们在一定程度上预测将来可能出现的新病原菌,并对预防新型传染病的出现具有一定的指导意义。

基因水平转移在微生物中尤其常见,其被认为是微生物适应新环境的一种需求〔13-14〕。目前,已知参与水平转移的基因大多与细菌的抗药性和致病性有关〔12〕。为了系统的研究耐药基因在细菌间的转移情况,本课题组设计了一种基于同一遗传背景下的细菌基因水平转移模型,并从志贺菌敏感株中获得了一株转移耐多药菌株。此前的比较基因组学研究表明,该转移株可能从供体菌中获得了多个基因。本实验应用PCR、斑点杂交等方法证明,该转移株所含有的T1C4基因片段来自供体菌,而且该基因片段在供体菌株和转移株中都存在于质粒上,这一结果确定了该基因片段在基因组上的位置,也证明了质粒在细菌基因水平转移中的重要意义。

通过比较3株不同的大肠埃希菌对14种抗生素的敏感性,发现与DH5α和 DH5α(pUC18)菌株相比,DH5α(pUC18-T1C4)菌株对其中6种抗生素具有一定的抗性。这一结果显示,T1C4基因片段可能介导细菌对多种抗生素的耐性。但是,本实验仅对该基因片段可能介导的耐药性做了耐药类型的筛选,具体在细菌耐药过程中扮演何种角色,尚需要作更进一步的研究。

〔1〕Tan YT,Tillett DJ,McKay lA.M olecular strategies for overcoming antibiotic resistance in bacteria〔 J〕.Molecular M edicine Today,2000,6(8):309-314.

〔2〕Hawkey PM.M olecular epidemiology of clinically significant antibiotic resistance genes〔J〕.British Journal of Pharmacology,2008,153(1):S406-S413.

〔3〕宋春花.志贺菌多重耐药的分子机制研究〔D〕.郑州大学博士学位论文,2007:20.

〔4〕Danquah M K,Forde GM.Growth medium selection and its oconomic impact on plasmid DNA production〔J〕.Bioscience and Bioengineering,2007,104(6):490-497.

〔5〕Sambrook J,Russell DW.分子克隆实验指南(上册)〔M〕 .3版.北京:科学技术出版社,2002:27-30.

〔6〕Borchardt SM,Foxman B,Chaffin DO,et al.Comparison of DNA dot blot hybridization and lancefield capillary precipitin methods for g roup B streptococcal capsular typing〔J〕.Clinical Microbiology,2004,42(1):146-150.

〔7〕Xie JJ,Foxman B,Zhang LX,et al.Molecular epidemiologic identification ofEscherichia coligenes that are potentially involved in movement of the organism from the intestinal tract to the vagina and bladder〔J〕.Clinical Microbiology,2006,44(7):2434-2441.

〔8〕Cattoir V,Poirel L,Rotimi V,et al.Multiplex PCR for detection of plasmid-mediated quinolone resistance qnr genes in ESBL-producing enterobacterial isolates〔J〕.Antimicrobial Chemotherapy,2007,60(2):394-397.

〔9〕朱静媛,段广才,郗园林.志贺菌对喹诺酮类药物耐药分子机制的研究〔J〕.中华流行病学杂志,2004,25(3):245-247.

〔10〕Wang KY,Guo YJ,Sun SH,et al.16S rRNA gene probe quantitates residual host cell DNA in pharmaceutical-g rade plasmid DNA〔J〕.Vaccine,2006,(24):2656-2661

〔11〕Li YH,Pan YP,Qi FX,et al.Identification ofStreptococcus sanguiniswith a PCR-Generated species-specific DNA probe〔J〕.Clinical Microbiology,2003,41(8):3481-3486

〔12〕Dutta C,Pan A.Horizontal gene transfer and bacterial diversity〔J〕.Indian Acad Sci,2002,27(1):27-33.

〔13〕Gogarten JP,Doolittle WF,Lawrence JG.Prokaryotic evolution in light of gene transfer〔J〕.Molecular Biology and Evolution,2002,19(12):2226-2238

〔14〕Zaneveld JR,Nemergut DR,Knight R.A re all horizontal gene transfers created equal?Prospects for mechanism-based studies of HG T patterns〔J〕.Microbiology,2008,154(1):1-15.

Identification on horizontal transfer of multi-drug resistance related gene fragment ofShigellaand its drug-resistance

WANG Shu-ling,SONG Chun-hua,DUAN Guang-cai,ZHANG Wei-dong,XI Yuan-lin,ZHU Jing-yuan
(Department of Epidemiology,College of Public Health,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

The objective of the present study was to identify horizontal transfer of gene fragment(T1C4)fromE.colitoShigellaand its relationship with multi-drug resistance.Screened positive clone which contains T1C4 gene fragment was cultured and the plasmid was extracted.The fragment of T1C4 gene was then amplified by PCR and purified by gel purification kit.The probe was prepared and the dot hybridization was conducted for genomic DNA and plasmid DNA ofShigellasensitive strain(SS23),transferred multi-drug resistantShigellastrain(ST11)andEscherichia colimulti-drug resistant clinical strain(E667).Finally,antimicrobial sensitivity of DH5α,DH5α(pUC18),DH5α(pUC18-T1C4)and ATCC25922 were detected by disk diffusion testing.The procedure was carried out in accordance with the guidelines in standard of antibiotics susceptibility test(Kirby-Bauer method)document.Results displayed that T1C4 gene fragment was amplified from genomic DNA of ST11 and E667 by PCR.The genomic DNAs and plasmid DNAs of transferred strain(ST11)and clinical strain(E667)all gave positive signals in dot hybridization,whereas both of genomic DNA and plasmid DNA of SS23 gave negative hybridization signal.The bacteriostatic diameters of Tetracycline,Cefazolin,Cefalotin,Norfloxacin and SMZ-TMP to DH5α(pUC18-T1C4)were significantly shorter than those to DH5α(pUC18).It's concluded that gene fragment(T1C4)was transferred from E667 to ST11 with plasmid.Moreover,T1C4 gene fragment might be closely related to multi-drug resistance of bacteria.

dot hybridization;horizontal gene transfer;Shigella;multi-drug resistance

R378.2

A

1002-2694(2010)09-0814-04

*卫生部科研基金资助课题(WKJ2007-2-024)

段广才,Email:gcduan@public.zz.ha.cn

郑州大学公共卫生学院,河南省分子医学重点学科开放实验室,郑州 450001

2009-07-19;

2010-01-09