欧阳凤菊，李兆利，赫明雷，刘慧芳，司 微，刘思国*，王春来，倪洪波，王 宇，曲娟娟*

(1.东北农业大学资源与环境学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室，黑龙江 哈尔滨 150001)

细菌生物被膜(Bacterial biofilm，BF)是细菌为适应自然环境，吸附于生物材料或机体腔道表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将自身包绕而形成的大量细菌聚集膜样物[1]，由此引起的相关感染性疾病及慢性感染的反复发作称为细菌BF病，又称菌膜病[2-3]。禽大肠杆菌(E.coli)感染是造成禽类胚胎和雏鸡死亡的重要原因，可引起禽类急性败血症、关节炎、卵黄性腹膜炎、输卵管炎、肺炎等一系列疾病[4]。当家禽感染禽致病性E.coli后，由于抗生药物的不合理使用，继而发展成为禽致病性E.coli BF病，不仅造成严重的经济损失，而且作为一种常见的人兽共患病，致病性E.coli通过食物链侵袭摄入者同时在体内形成生物被膜病，对人类健康同样有着极大的威胁。

菌种类型、接入菌量、载体类型、营养条件和外界环境[5-7]诸多因素都影响BF的形成。观察禽致病性E.coliBF的形成周期，了解不同条件下BF中细菌粘附载体的程度，为进一步明确BF的形成机制提供了实验依据，对抑制禽致病性E.coliBF形成具有指导意义。

1 材料和方法

1.1 实验材料 菌种为一株野生禽致病性E.coli，由哈尔滨兽医研究所细菌室分离鉴定保存；生物培养膜片、平底24孔细胞培养板、U底96孔细胞培养板均为Corning Costar产品、一次性血凝板、Maconkey培养基、LB培养基、M63培养基[8]、5%TSB培养基[9]均为BD Falcon产品；结晶紫染液为Baso产品。

1.2 禽致病性E.coli种子液的制备 将野生禽致病性E.coli在麦康凯琼脂培养基上活化后，挑取单菌落分别接种于LB培养基、5%TSB培养基培养、M63培养基，37℃、220 r/min过夜培养至活菌数达到约108cfu/mL，备用。

1.3 BF体外定性实验 利用改良的平板培养法[10]进行BF定性检测。将生物培养膜片分别放入每孔含有1.0 mL 5%TSB培养基的24孔板中，然后在各孔中加入0.5麦氏浓度的菌液100 μL，37℃恒温培养。银染法[11]对体外形成的BF进行染色，用显微镜直接观察到BF。

玻璃试管法按照文献[12]的方法进行检测。在1 mL液体培养基的玻璃试管(12 mm×100 mm)中接种1%相应培养基的禽致病性E.coli，37℃静止培养后，弃培养液，用1.5 mL 1%结晶紫室温下染色30 min，染色液除去，室温干燥。肉眼观察液面与空气接触处的玻璃试管壁。

1.4 BF定量检测 采用改良后的微孔板BF检测方法[13]。在96孔板中加入150 μL液体培养基，接种1%禽致病性E.coli种子液，恒温培。培养结束后，用200μLPBS清洗3次，150μL甲醇固定15min。晾干培养板后，向每孔入150 μL 1%结晶紫染液，染色5 min，自来水冲去多余染色液，晾干；再加入150 μL 33%(v/v)冰醋酸溶液溶解结晶紫，测定OD630nm值。每次试验接3孔，检测3次，取平均值。未接种的微孔OD值作为阴性对照。

OD630nm值判定标准[14]，将阴性对照平均OD值(X)加上其3倍的标准差SD定义为临界值(cut-off值，ODc)。基于临界值ODc，菌株BF可以分为：OD≤ODc为不粘附(-)，ODc3ODc强粘附(+++)。

1.5 禽致病性E.coliBF形成的影响因素

1.5.1 培养时间 在8 h、24 h、36 h、48 h、72 h后，按照上述方法分别对BF形成情况进行定量和定性检测。

1.5.2 液体培养基 采用3种不同的液体培养基，包括LB培养基、5%TSB培养基和添加Casamino Acid的M63培养基，按照上述方法检测BF。

1.5.3 BF载体 采用不同的培养载体检测BF。载体包括不同品牌的96孔细胞培养板(Corning Costar、Nunclon、Orange)、一次性血凝板硅胶生物培养膜片，玻璃试管。

1.5.4 营养成分 选择营养成分相对较少的M63(Casamino Acid)培养基，添加以下营养成分，用优化后的最佳条件培养禽致病性E.coli，按照上述方法检测BF形成，确定不同营养成分对BF的影响。

在含有不同浓度的葡萄糖、蔗糖(每种糖浓度分别设为0.2%、0.5%、1%、2%、3%、5%)的M63培养基按1%接种量分别接种禽致病性E.coli种子液，37℃培养48 h后检测。

在含不同浓度的氯化钠(0.2%、0.5%、1%、2%、3%、5%)的M63培养基。

在含不同浓度的MgSO4(0.2%、0.5%、1%、2%、3%、5%)的M63培养基。

2 结果

2.1 定性检测不同条件对BF的影响 显微镜观察BF的形成结果表明：试验菌株BF在8 h处于细菌起始粘附过程，可观察到少量细菌开始粘附于载体上；24 h细菌开始大量的粘附，有若干微菌落形成；至48 h已经形成成熟完整BF，大量微菌落连成片状；72 h后微菌落减少，BF开始脱落，新的一轮BF开始形成(图1)。

利用玻璃试管法直观在试管壁上观察BF：接种后24 h大量细菌开始粘附于试管壁，至48 h时形成完整的BF，72 h后细菌开始脱落；但在营养匮乏的M63培养基中，虽然接种后8 h就有细菌粘附，36 h BF生长状态最佳，但与LB中的BF比较，膜薄且膜内细菌粘附性差。在5%TSB培养基上，在接种后36 h细菌开始粘附，48 h时被膜最厚(图2)。

图1 5%TSB培养基、硅胶生物培养膜片上不同培养时间形成BF（银染法×100）Fig.1 The biofilm devolpment at 37℃ in 5%TSB medium on the Bio-cultural material at different time point by silver staining(×100)

图2 3种培养基中玻璃试管上不同培养时间所形成的BFFig.2 The biofilm devolped at different times post inoculation in different mediums

2.2 定量检测不同条件对BF的影响 通过OD630nm值检测BF的强弱程度，结果显示当血凝板作为载体时，在LB和M63培养基上，试验菌株在24 h时OD值达到最大值而后逐渐降低，此时BF粘附性最强(++)；但在5%TSB培养基上，72 h时OD值显示仍为弱粘附状态(+)，该培养条件不利于试验菌BF的形成；采用不同品牌的96孔细胞培养板作为载体时，用5%TSB培养基培养48 h，试验菌在Costar(OD630nm=0.246)和 Orange(OD630nm=0.265)两 种96孔板均能产生强BF(+++)，见图3。

2.3 定量检测不同营养成分对BF的影响 在营养成分较单一的M63中添加糖类物质，BF的OD值明显升高。培养基中添加葡萄糖容易被细菌利用，大量细菌粘附于载体上，形成了强BF；葡萄糖浓度越高(<3%)，被膜粘附性越强。培养基中添加蔗糖，细菌粘附状态由弱转变成中等粘附；蔗糖浓度>1%，OD值不再明显提高。添加低浓度的NaCl可以促进该菌BF的形成；高浓度的NaCl抑制细菌的生长甚至杀死细菌，从而完全抑制BF的形成。添加终浓度为1%MgSO4时，OD值升高，Mg2+能够促进BF的形成(图 4)。

3 讨论

图3 不同培养基、不同载体、不同培养时间对BF的影响Fig.3 Effects of different temperatures,mediums and adherent materials onE.colibiofilm development

图4 不同营养成分对BF的影响(OD630nm)Fig.4 Effects of glucose,sucrose,sodium chloride,and sodium sulfate concentration on biofilm development of E.coli

本实验采用BF体外定性实验和定量粘附性实验对一株野生禽致病性E.coli生被膜的生长情况进行了72 h的连续观察。实验结果清晰地展示了禽致病性E.coliBF形成周期的5个阶段：起始附着阶段、粘附阶段、形成早期的BF、形成成熟的BF、老化散播阶段。其形成周期与铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、禽沙门氏菌等细菌BF的形成周期[15]是一致的。BF形成过程是比较复杂的。首先是细菌黏附于附着物表面，之后即开始生长，在这一过程中将分泌大量胞外多聚物(Extracellular polymeric substances，EPS)形成微菌落使BF结构加厚[16]。成熟的BF结构是不均质的，在大量的微菌落之间还分布有运送养料和代谢产物以及排出废物的通道。最后，浮游菌从成熟的膜内释放，在新的部位形成新的菌落。因此，控制BF的形成一般要在其形成的初期给予抗生素药物抑制细菌的生长。确定禽E.coliBF形成周期对于临床治疗禽E.coli疾病是十分重要的。

本研究中体外定性实验是通过平板培养法和玻璃试管法完成的。相同培养基时，生物培养膜片(硅胶)和玻璃试管上的BF生长周期几乎是一致的。即5%TSB培养基中的完整的BF均是在48 h时形成的；平板培养法从微观角度更好地体现了从起始到形成完整BF细菌粘附的过程。不同培养基玻璃试管为载体时，M63培养基8 h时已经有明显的细菌粘附且在36 h就出现了完整的BF，随后72 h BF变薄。这一过程与其他培养基中BF形成阶段有差别，可能由于M63培养基营养成分较少，随着营养物质消耗、代谢废物的聚集使浮游细菌提前进入一种饥饿状态(类芽孢状态)[17]，处于类芽孢生长状态的细菌粘附于玻璃试管壁形成被膜，此时的细菌像芽孢一样对物理和化学消毒剂有强大的抵抗力。

依据遗传学研究和多聚糖分析的证实：在E.coli和表皮葡萄球菌等多种细菌中，BF的完整性依赖于β-1，6-N-乙酰-D-葡萄糖胺的多聚化[18]。我们发现在营养成分相对较少的M63培养基，添加葡萄糖、蔗糖、低浓度盐和Mg2+对禽致病性E.coli BF形成有一定的促进作用。糖类作为碳源营养物质不但有利于细菌生长繁殖，同时也是糖代谢的主要物质来源，促使细菌产生大量多糖复合物使微菌落大量粘连，形成更强的BF。有研究认为钠、镁等阳性金属离子是常常作为带负电的细菌和带负电的物体表面(自然界多数表面都带负电)连接的桥梁。但MartnsiL等认为Mn2+，Mg2+等金属离子影响合成酶的活性，这些合成酶是用来调控藻酸盐的合成[14]。

BF作为自然界中细菌主要的生存方式，给人类的生产生活带来了严重危害。建立禽致病性E.coli BF的体外模型，为进一步探讨细菌粘附和细菌BF的形成机理、阻断细菌BF的形成提供了实验依据。

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