罗 俊，刘业兵，陈 坚，宁宜宝

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081；2.北京信得威特科技有限公司，北京 100302；3.广东永顺生物制药有限公司，广东 广州 511356)

猪流感(Swine influenza，SI)是由正粘病毒科SI病毒(SIV)引起的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病。不同日龄、性别和品种的猪均可感染该病[1-2]。目前，已发现的A型SIV有H1N1、H3N2、H9N2等11种血清亚型，我国流行的血清亚型主要有人源H3N2、经典猪源H1N1和类禽源H1N1[3]。

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的一种高度接触性传染病。临床上以母猪妊娠后期的繁殖障碍，新生仔猪的呼吸症状和仔猪的高死亡率为特征[4]。

近年来，SIV和PRRSV在临床上多为混合感染，并且临床症状不典型，仅根据临床症状确诊比较困难。传统的鉴别诊断方法是病原分离鉴定和血清学诊断，但所需时间较长，在混合感染诊断中存在不够灵敏的情况。RT-PCR技术具有快速、敏感和易于操作的特点，被广泛应用于畜禽传染病的检测和鉴别诊断[5]。多重RT-PCR技术是在RT-PCR基础上发展起来的一种检测技术，一次RT-PCR反应能同时检测多种病原，具有简便、快速的鉴别和检测多种病原的优点，能够同时满足多种疾病诊断的要求。为此，本研究进行了SIV和PRRSV的双重RT-PCR检测方法的研究。

1 材料和方法

1.1 病毒株和细胞 H1N1和H3N2型SIV、禽流感(AIV)H9N2分离株、PRRSV VR-2332和BJ分离株、Marc-145细胞均由本实验室保存；H5亚型AIV灭活抗原由哈尔滨兽医研究所提供；猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)由本研究所猪瘟参考实验室提供；9日龄～10日龄SPF鸡胚购自北京中海公司。

1.2 主要试剂 TRIzol、PfuUItraTMⅡFusion HS DNA Polymerase、SuperScriptTMⅢ Reverase和 Transcriptase均购自Invitrogen公司；pGEM-T购自Promega公司；TOP10菌株购自天根生化科技(北京)有限公司；总RNA提取试剂盒购自OMEGA公司。

1.3 引物设计 根据SIV亚型M基因保守序列设计SIV检测引物，M-F：5'-TCAGGCCCCCTCAAA G-3'和 M-R： 5'-TATGAGGCCCATGCAACT-3'， 扩增片段为345 bp。根据PRRSV美洲型毒株N基因保守序列设计PRRSV检测引物，P-F：5'-GTGGCA GAAAAGCTGTTAAG-3'和 P-R：5'-TTGAATAGGTG ACTTAGAGGC-3'，扩增片段为520 bp。引物由英潍捷基北京公司合成。

1.4 病毒培养 将PRRSV BJ株接种单层Marc-145细胞，37℃吸附1 h，加入含2%牛血清的DMEM营养液培养，75%细胞病变(CPE)时收毒，病毒含量为105.3TCID50/0.1 mL； H1N1亚型SIV接种9日龄～10日龄SPF鸡胚尿囊腔，72 h收获尿囊液，病毒含量为104.5EID50/0.1 mL。

1.5 RNA提取及反转录 按总RNA提取试剂盒说明书提取病毒RNA，并进行反转录。反应体系为：病毒总 RNA 10 μL，dNTP 2 μL，5×FS Buffer 4 μL，0.1 mol/L DTT 1 μL， SuperScriptTMⅢ 0.5 μL，RNase inhibiter 0.5 μL，SIV上游引物、PRRSV下游引物各1 μL。反转录条件为：42℃ 60 min，75℃15 min。

1.6 双重RT-PCR方法的建立 反应体系为：10×buffer 2.5 μL，cDNA 2 μL，dNTP(10 mM)2 μL，Taq酶5 u，引物各1 μL，灭菌去离子水补足至25 μL，混匀后以不同的退火温度、延伸温度和时间及循环次数等进行优化。

1.7 PCR产物鉴定 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳观察结果。检测阳性的PCR产物由英潍捷基北京公司测序。

1.8 敏感性试验 将收获的PRRSV BJ株病毒液用DMEM培养液分别稀释为1×105TCID50/0.1 mL、1×104TCID50/0.1 mL、1×103TCID50/0.1 mL、1×102TCID50/0.1 mL和1×10 TCID50/0.1 mL进行RT-PCR检测；将SIV H1N1分离株鸡胚尿囊液用PBS分别稀释为 1×104EID50/0.1 mL、1×103EID50/0.1 mL、1×102EID50/0.1 mL、1×10 EID50/0.1 mL和 1 EID50/0.1 mL进行RT-PCR检测。同时，相应稀释两种病毒各取100 μL混合后提取RNA进行PCR扩增。

1.9 特异性试验 对CSFV、阴性鸡胚尿囊液与PRRSV BJ株、SIV H1N1、SIV H3N2同时提取RNA并反转录，提取PRV、PPV、PCV2 DNA，同时进行PCR扩增。

1.10 双重RT-PCR的应用 将12份疑似病料分别研磨，制成混悬液，4℃3000 r/min离心10 min，取上清液。将各样品上清液分为3份，一份用于双重RT-PCR检测，一份接种鸡胚分离病毒，一份接种Marc-145细胞分离病毒，比较检测结果。

2 结果

2.1 双重RT-PCR反应的建立 对双重RT-PCR反应体系的退火和延伸温度、时间以及循环次数进行优化，确定反应条件为：94℃ 2 min；94℃ 30 s、51℃ 30 s、72℃ 1 min，35次循环；72℃ 3 min。利用引物M-F、M-R和P-F、P-R在同一个反应体系中按上述方法扩增出PRRSV基因组中520 bp和SIV基因组中325 bp 2个片段(图1)。

图1 双重RT-PCR扩增结果电泳图Fig.1 Detection of PRRSV,SIV and AIV by duplex RT-PCR amplification

2.2 PCR产物的鉴定 将RT-PCR产物纯化，连接到pGEM-T载体中测序。测序结果用DNAStar软件与GenBank中登录序列进行BLAST分析，结果表明扩增的特异性片段与GenBank登录的两种病毒核酸序列的同源性均达98%以上。

2.3 敏感性试验 结果表明：SIV和PRRSV单重RT-PCR的最低有效检测量分别为10 EID50/0.1 mL和102TCID50/0.1 mL；所建立的双重RT-PCR检测方法SIV和PRRSV的最低有效检测量分别为102EID50/0.1 mL 和 103TCID50/0.1 mL(图 2)。

2.4 特异性试验 对8种病毒的DNA进行双重PCR检测，结果显示：PRRSV BJ株、SIV H1N1、SIV H3N2扩增得到特异性条带，而CSFV、PRV、PPV、PCV2及阴性鸡胚尿囊液均未见扩增条带，表明引物的特异性较高，适合SIV和PRRSV双重PCR 检测(图 3)。

2.5 双重RT-PCR的应用 利用建立的双重RT-PCR方法对临床12份疑似病料样品进行检测，结果显示：12份疑似病料样品中7份为PRRSV单独感染，2份为SIV单独感染，3份为PRRSV和SIV混合感染。

病毒分离结果显示：7份PRRSV单独感染样品和2份混合感染样品用Marc-145细胞均分离到PRRSV，另外1份用双重RT-PCR检测为双阳性的混合感染病料样品未分离到PRRSV，2份SIV单独感染样品和3份混合感染样品用鸡胚均分离到SIV，表明双重RT-PCR检测与病毒分离结果基本相符。

图2 PRRSV和SIV RT-PCR敏感性试验Fig.2 Sensitivity test of the RT-PCR assay for detection of PRRSV and SIV

3 讨论

本研究利用扩增SIV和PRRSV的特异性引物建立了双重RT-PCR检测方法，该双重RT-PCR方法敏感、特异。其中，反转录选用特异性引物，减少了非特异性条带的产生。本实验也曾改变引物浓度以期获得更好的扩增效果，但最终效果并不明显。有试验表明先加入大片段引物进行PCR扩增若干循环后，再加入小片段引物进行多联PCR扩增，取得了较好的效果[6]，但该方法程序比较繁琐。

图3 双重RT-PCR特异性试验Fig.3 Specificity test of the duplex RT-PCR amplification

对于双重RT-PCR方法的敏感性，本研究用相同的条件分别进行了SIV和PRRSV的单重和双重RT-PCR敏感性试验，结果显示SIV单重和双重RT-PCR的最低有效检测量比Lee建立的单重RT-PCR(1 EID50/mL)和 SIV H1N1、H1N2、H3N2 多重RT-PCR检测方法(10 EID50/mL)的最低有效检测量低，可能是因为Lee设计引物依据于不同亚型的特异片段，而本研究的引物依据于不同亚型的共同保守片段，更为重要的是Lee基于DPO(Dual priming oligonucleotide system)技术，该技术可以极大的提高PCR的敏感性与特异性[7]。本方法的PRRSV单重RT-PCR和双重RT-PCR的最低有效检测量分别为102TCID50/0.1 mL和103TCID50/0.1 mL，比Hirohito建立的多重RT-PCR的最低有效检测量(1×103TCID50/0.2 mL 和 2×103TCID50/0.2 mL)略高[6]。虽然多重RT-PCR的敏感性受到多种因素的影响，目前也无具体判定标准，但是它基于PCR技术所表现出的灵敏性足以满足临床检测要求。

利用双重RT-PCR对临床12份疑似病料样品进行检测，其中1份病料样品应用双重RT-PCR检测为SIV和PRRSV混合感染，但仅分离到SIV，可能是因为不同的PRRSV毒株对Marc-145细胞的适应性不同，所以出现该情况属正常，表明传统的病毒分离存在灵敏度低的缺点。

本研究建立的双重RT-PCR方法具有敏感、特异、快速、可重复等优点，检测病原只需4 h～5 h，为SIV和PRRSV混合感染的快速检测和流行病学调查奠定基础。

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[2]Wesley R D,Lager K M.Evaluation of a recombinant human adenovirus 25 vaccine administered via needle 2 free device and intramuscular injection for vaccination of pigs against swine influenza virus[J].Am J Vet Res,2005,66(11):1943-1947.

[3]李海燕，于康震，杨焕良，等.中国猪源H5N1和H9N2亚型流感病毒的分离鉴定[J].中国预防兽医学报，2004，26(1)：1-6.

[4]Nielsen H S,Liu G,Nielsen J,et al.Generation of an infectiousclones of VR-2332,a highly virulent north American-type isolate of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].J Virol,2003,3:3702-3711.

[5]刘建柱，瞿玉东，李鹏，等.多重PCR检测猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒[J].中国兽医学报，2003，23(6)：535-537.

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[7]Lee C S,Kang B K,Lee D H,et al.One-step multiplex RT-PCR for detection and subtyping of swine influenza H1,H3,N1,N2 viruses in clinical samples using a dual priming oligonucleotide(DPO)system[J].J Virol,2008,151:30-34.