魏 峰，殷丽红，许 越，杨欢欢，张西臣

(1.吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118；2.吉林大学畜牧兽医学院，吉林 长春 130062)

柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是球虫病爆发中致病性最强的虫种之一，主要侵害鸡盲肠，通过裂殖体在盲肠上皮细胞中大量增殖，破坏肠黏膜，引起肠管发炎和上皮细胞崩解[1-2]。目前，药物防治多采用抗生素类和化学合成药物，但由于耐药虫株的出现及残留药物对人体的危害，使药物防治受到限制[3]。免疫预防已成为当前研究的热点，但目前对球虫的免疫机制尚未完全阐明，同种不同株、不同发育阶段的虫体抗原成分均存在一定的差异。因此，鉴定其共同保护性抗原对球虫疫苗的研制及免疫机理的研究具有重要的意义。吉林大学农学部寄生虫研究室利用E.tenella广州株、长春株、黑龙江株杂交获得杂交株，为研究球虫共同保护性抗原奠定基础[4]。本研究通过E.tenella杂交株对其亲本株的免疫保护性实验，研究杂交株对亲本株的免疫保护及细胞免疫在球虫免疫中的作用，从而，为球虫免疫机理研究和疫苗研制奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 虫株E.tenella广州株为广东农业科学院蔡建平研究员惠赠；E.tenella长春株及黑龙江株均为吉林大学农学部寄生虫研究室保存；E.tenella杂交株为吉林大学农学部寄生虫研究室利用E.tenella广州株、长春株和黑龙江株杂交获得。

1.2 实验动物及饲养 1日龄AA肉鸡500只购自吉林德大肉种鸡公司，自行配制无抗球虫药全价饲料，80℃烘烤1 h，自由采食、饮水，24 h光照，严格消毒，在无球虫环境下饲养，10日龄～11日龄连续2 d粪检无球虫卵囊鸡用于试验。

1.3 免疫保护性检测

1.3.1 免疫保护率测定 12日龄时逐只称重，淘汰体重过大和过小者，400只无球虫雏鸡随机分为20组，每组20只；用E.tenella广州株、长春株、黑龙江株、杂交株各感染4组，剂量为1×104个卵囊/只，设4个不感染对照组。24日龄时分别用广州株、长春株、黑龙江株和杂交株对各组鸡攻虫，剂量为103个卵囊/只；攻虫后7 d进行OPG计数、粪便计分、盲肠病变计分[5]、平均增重和保护率计算，分析各数据(表1)。

保护率＝(各株空白组攻虫OPG数-各株攻虫后OPG数)/各株空白组攻虫OPG数

1.3.2 细胞免疫检测 50只12日龄无球虫AA肉鸡随机分成1个空白对照组，4个实验组，每组10只。实验组12日龄用杂交株感染，剂量为104个卵囊/只，24日龄时分别用广州株、长春株、黑龙江株和杂交株攻虫，剂量为103个卵囊/只，攻虫后10 d，各组鸡翅下采血1 mL，抗凝处理后进行鼠抗鸡CD4+T、CD8+T单克隆抗体(MAb)标记，标记血样利用流式细胞仪检测CD4+T、CD8+T细胞水平，比较各亲本株攻虫后对鸡细胞免疫的影响(表2)。

表1 杂交株及各亲本株免疫保护性Table 1 Immuneprotection of chickens immunized withE.teuellahybrid strain against different parent strain challenging(n=20)

表2 杂交株免疫雏鸡对亲本株攻虫后CD4+T、CD8+T细胞检测Table 2 CD4+T and CD8+T cell level of chickens immunized with hybird strain and challenged by parent strains(n=10)

2 结果与讨论

2.1 免疫保护率结果 表1结果显示：E.tenella杂交株、广州株、长春株和黑龙江株对同株的免疫保护率分别为87.7%、83.6%、72.5%和75.1%；广州株、长春株和黑龙江株对其它亲本株的平均免疫保护率为64.9%、60.4%和65.1%，而杂交株免疫的雏鸡对广州株、长春株和黑龙江株3个亲本株的免疫保护率分别为83.9%、79.1%和81.2%，平均为81.4%，极显著高于其它地理株的交叉保护率(p<0.01)。杂交株对其亲本株的免疫保护率较高，而各亲本株对其他株的攻虫免疫保护率较低，免疫保护率顺序为：杂交株(81.4%)>黑龙江株(65.1%)>广州株(64.9%)>长春株(60.4%)，杂交株可能遗传了3个亲本株的某些性状(如抗原等)，特别是杂交株对长春株和黑龙江株的免疫保护率高于其他株，其原因有待于进一步研究。而盲肠病变计分和粪便计分试验结果显示：杂交株显著低于广州株、长春株和黑龙江株(p<0.05)；所有免疫组雏鸡平均增重均高于空白对照组，表明经过免疫后雏鸡获得保护力，能够抵抗球虫的再次感染。各株的致病性有明显差异，其顺序为(以OPG计)：广州株>长春株>黑龙江株>杂交株，杂交株致病性较弱而其免疫保护率较高。对球虫免疫研究显示，不同种的球虫抗原存在差异，同种不同株间也存在着抗原差异，同一个体的不同发育阶段抗原也不相同。本实验结果表明E.tenella广州株、长春株和黑龙江株之间存在抗原差异。

2.2 细胞免疫结果 表2结果显示：4个试验组的雏鸡外周血液中CD4+T、CD8+T细胞数量均显著高于对照组，其中以杂交株和广东株较高，各组引起的CD4+T数量增加明显高于CD8+T数量增加，CD4+T/CD8+T差别不大，表明不同杂交株球虫感染能够引起明显的细胞免疫。在球虫的免疫机制中抗体的作用很小[6]，CD4+T、CD8+T细胞在免疫中发挥着重要作用[7-8]，本实验中，CD4+T、CD8+T细胞在攻虫10 d后其数量均有明显增加，尤其是CD4+T细胞增加较多，试验组CD4+T/CD8+T比值显著高于对照组。该实验结果与Shirle对耐药杂交株可耐受多种药物的结果相似，也与吉林大学分子寄生虫学研究室的研究结果相似[9-10]。这些研究为鸡球虫活苗在不同地区的正确使用提供了依据，为下一步找出球虫保护性抗原奠定了基础。

[1]Dalloul R A,Lillehoj H S.Recent advances in immunomo-dulation and vaccination strategies against coccidiosis[J].Avian Dis,2005,49:1-8.

[2]Allen P C,Fetterer R H.Recent advances in biology and immunobiology of Eimeriaspecies and in diagnosis and control of infection with these coccidian parasites of poultry[J].Clin Microbiol Rev,2002,15:58-65.

[3]Vertommen M H,Deek H W.How can a resistance problem be broken[J].World Poultry,1993,9:19-21.

[4]赵权，张西臣.不同地理株及其杂交株柔嫩艾美耳球虫免疫保护性研究[J].吉林农业大学学报，2005，27(1)：100-103.

[5]索勋，李国清.球虫病学[M].北京：中国农业大学出版社，1998，357-396.

[6]段嘉树，程金科，赵树英，等.球虫疫苗免疫防治纵横谈[J].当代畜牧，1994，12：13-20.

[7]查红波，蒋金书.球虫保护性免疫机制[J].中国兽医杂志1997，23(11)：47-48.

[8]Arakawa A,Xie M Q.Control of coccidiosis in chickens[J].J Protozool Res,1993,3:31-39.

[9]Shirley M W.A molecular karyotype of Eimeria tenellaasrevealed by contourclamped homogenous electric field gel electrophoresis[J].Mol Biochem Parasitol,1990,38:169.

[10]张伟信，张西臣，李建华，等.五种不同地理株柔嫩艾美耳球虫免疫保护性比较[J].中国预防兽医学报，2006，4：454-456.