徐 佳，邵昱昊，韩宗玺，李慧昕，孔宪刚，刘胜旺

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150001)

鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)为Nido病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属抗原三群的代表[1]，能引起鸡的急性、高度接触性传染病。呼吸道上皮细胞为IBV的主要增殖部位，感染鸡表现呼吸道症状。但部分病毒株也可以在感染鸡的肾脏、输卵管和肠道等组织器官的上皮细胞中复制和增殖，损害肾脏，造成感染鸡死亡，蛋鸡产蛋量下降，给养禽业造成严重的经济损失。

IBV含有4种结构蛋白：纤突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核蛋白(N)。IBV的N蛋白由mRNA65'端独特区编码，分子量约为45 ku，磷酸化后分子量约为51 ku，占病毒蛋白总量的40%。N蛋白对病毒基因组的复制、亚基因组RNA转录、翻译具有一定作用。而且N蛋白具有良好的免疫原性，是诱导体液免疫应答和细胞免疫应答的重要免疫原蛋白[2]。

本研究应用杂交瘤技术获得分泌抗IBV N蛋白MAb的杂交瘤细胞株，为建立鸡传染性支气管炎(IB)检测方法及相关研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料 IBV tl/CH/LDT3/03[3]、IBV分离株CK/CH/LDL/97Ⅰ、IBN、M41、CK/CH/LSD/05Ⅰ、CK/CH/LHN/00Ⅰ和CK/CH/LAH/08Ⅱ的N蛋白、BL21(DE3)和SP2/0细胞均由本实验室保存；雌性BALB/c小鼠由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供；pGEX-6p-1购自Amersham-Pharmacia公司；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自SEPPIC MONTANIDETM公司；二氨基联苯胺(DAB)、HAT、HT和聚乙二醇(PEG1450)均购自Invirogen公司；MAb亚类鉴定试剂盒购自Southern Biotech公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠lgG购自Sigma公司。

1.2 抗原的制备 将tl/CH/LDT3/03分离株尿囊腔接种9日龄～11日龄SPF鸡胚，37℃培养72 h，收集尿囊液。1000 r/min 4℃离心30 min，收集上清，3500 r/min离心30 min，将上清12000 r/min离心30 min，收集上清。100000 r/min超速离心3 h。回收沉淀，紫外分光光度计测定浓度。

1.3 动物免疫 取适量浓缩的抗原与等量弗氏完全佐剂乳化，皮下和腹腔免疫6周龄～8周龄BALB/c小鼠(0.2 mL/只)，2周后将适量抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，进行第2次免疫，14 d后三免，融合前3 d经尾静脉注射加强免疫1次。

1.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 加强免疫后的小鼠脾细胞采用常规方法进行细胞融合，融合后10 d，以N蛋白作为检测抗原，采用western blot方法进行筛选，将获得的稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株扩大培养并保存于液氮中。

1.5 MAb亚类的鉴定 按照Southern Biotech公司MAb亚类鉴定试剂盒说明书进行。

1.6 杂交瘤细胞的染色体计数 以秋水仙素预处理杂交瘤细胞，0.075 mol/L KCl溶液低渗处理，经甲醇-冰醋酸溶液固定，用Giemsa染液染色并进行染色体计数。

1.7 MAb表位的初步鉴定

1.7.1 IBV N基因的分段克隆、表达及鉴定 根据对tl/CH/LDT3/03株N基因核苷酸序列分析，设计5对引物，分别克隆至pGEX-6p-1载体中，并转化至BL21感受态细胞中进行表达，将表达的6种蛋白依次 命 名 为 GST-N、GST-N1、GST-N2、GST-N3、GST-N4和GST-N5。在N1上设计3对引物，分别克隆到pGEX-6p-1载体中，分别转化至BL21感受态细胞内表达，将表达的3种蛋白依次命名为GST-N1-1、GST-N1-2、GST-N1-3(图 1)。

图1 分段表达的蛋白在N蛋白中对应的氨基酸位置Fig.1 Location of expressed N fragments in full length N gene

1.7.2 抗原表位的初步定位 将表达的蛋白进行SDS-PAGE及western blot鉴定，其中，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG，DAB显色。

1.7.3 ELISA检测MAb与N基因表达产物的反应性 表达产物经SDS-PAGE和western blot鉴定，对第一轮表达的6段蛋白进行切胶纯化，分别按10 μg/孔包被酶标板，同时设空载体诱导产物对照。BSA溶液37℃封闭2 h，分别加入MAb，37℃反应1.5 h，1∶5000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG 37℃反应1.5 h，OPD显色，检测OD490nm值。

1.8 MAb 6F9与其他IBV分离株核蛋白反应性将接种不同IBV分离株的鸡胚尿囊液进行SDS-PAGE分析，并转印至硝酸纤维素膜上，4℃封闭过夜，加入杂交瘤细胞上清，37℃反应2 h，1∶5000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG 37℃反应2 h，DAB显色。

2 结果

2.1 阳性杂交瘤细胞筛选 经克隆、筛选获得两株稳定分泌针对IBV N蛋白的MAb，分别命名为6H3和6F9。

2.2 MAb亚型的鉴定 利用MAb亚型鉴定试剂盒对得到的两株MAb进行亚型鉴定结果显示：6H3为IgG1，6F9为IgG2b，两株MAb的轻链均为κ链。

2.3 杂交瘤细胞的染色体计数 染色体计数结果显示：分泌MAb 6H3的杂交瘤细胞染色体数目为90，分泌MAb 6F9的杂交瘤细胞染色体数目为102。

2.4 MAb 6H3、6F9抗原表位的初步定位

2.4.1 IBV N基因的分段克隆、表达及western blot分析 收集阳性重组菌，进行SDS-PAGE分析，结果显示目的蛋白均得到表达，并且与预期大小相符(图 2)，western blot分析结果显示 MAb 6H3与GST-N、GST-N1和 GST-N2及 MAb 6F9与 GST-N和GST-N1反应均呈阳性(图3、4)。

2.4.2 MAb与N基因表达产物的反应性的ELISA检测 纯化的6段蛋白作为包被抗原，用pGEX-6p-1空载体诱导物作阴性对照进行间接ELISA。结果显示：MAb 6H3与GST-N、GST-N1和GST-N2呈阳性反应，MAb 6F9与GST-N和GST-N1呈阳性反应(图5)，这与western blot分析结果一致。

图5 MAb 6H3和6F9检测各蛋白的间接ELISA结果Fig.5 Reactivity of different GST truncated N protein with the 6H3 and 6F9 by indirect ELISA

2.4.3 IBV N1基因的表达以及western blot分析SDS-PAGE结果显示，GST-N1-1、GST-N1-2、GSTN1-3均得到表达，与预期大小相符(图6-A)。MAb 6F9的western blot结果显示，MAb 6F9与GST-N1-2和GST-N1-3均呈阳性反应(图6-B)。

图 6 IBV N1基因分段表达产物的SDS-PAGE(A)与western blot分析(B)Fig.6 SDS-PAGE analysis of expressed N1 protein(A)and western blot analysis of expressed N1 protein with MAb 6F9(B)

2.5 MAb 6F9与其他IBV反应结果 MAb 6F9可与 CK/CH/LDL/97Ⅰ、IBN、M41、CK/CH/LSD/05Ⅰ和CK/CH/LHN/00Ⅰ的N蛋白发生特异性反应，而与CK/CH/LAH/08Ⅱ反应呈阴性(图7)。

3 讨论

图7 MAb 6F9与IBV N蛋白的western blot分析Fig.7 Binding activity of MAb 6F9 with N protein of other IBV isolates by western blot

以往研究认为IBV N基因进化比较保守[5-6]，但刘胜旺等研究表明，在N基因内部存在点突变现象[7]。可能导致N蛋白抗原表位及功能变化，其中有些变异可能改变病毒的某些生物学特性[5]。IBV tl/CH/LDT3/03是本实验室2003年从水鸭中分离出的一株病毒，该分离株主要致肾脏病变[4]，用该病毒免疫小鼠，得到针对该株病毒N蛋白的两株MAb 6H3和6F9，其中MAb 6F9与另外5株不同致病性和组织嗜性的IBV分离株CK/CH/LDL/97Ⅰ、IBN、M41、CK/CH/LHN/00Ⅰ和 CK/CH/LSD/05Ⅰ的N蛋白发生特异性结合反应，推测这5个分离株与tl/CH/LDT3/03具有相同的一个线性表位。而CK/CH/LAH/08Ⅱ在该表位上可能存在关键氨基酸的替换，导致与MAb 6F9不反应。而有研究表明对不同IBV分离株的N蛋白进行比对显示，在氨基端100位内存在几个氨基酸替换，而在羧基端却很保守[5]。这些氨基酸的替换可能影响表位的结构，进而改变病毒N蛋白的抗原性。

目前，关于IBV N蛋白特异性抗原表位的研究报道较少。Boot等在IBV N蛋白的aa 71～aa 78位鉴定出一个T细胞表位[8]。Ignjatovic等利用MAb对N蛋白进行抗原表位分析，发现8个MAb(1、7、9、16、24、26、27和51)能直接与N蛋白7个非重叠表位结合，表明N蛋白至少有7个以上抗原表位[9]。Seah等利用鸡的康复血清对M41 IBV分离株核蛋白的线性B细胞表位进行定位，发现线性免疫优势B细胞表位主要分布于7个片段中：aa 1～aa 50、aa 40～aa 90、aa 140～aa 180、aa 175～aa 209、aa 195～aa 241、aa 310～aa 370和 aa 360～aa 409，其中在aa 40～aa 90和aa 140～aa 180两个片段阳性反应较弱，这可能由于2个片段中存在较少的表位[10]。本研究得到的MAb 6H3表位初步定位在aa 80～aa 99，而MAb 6F9表位初步定位在aa 64～aa 82，位于aa 40～aa 90，其精确的表位鉴定有待进一步研究。

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[2]Ignjatovic J,Galli L.Structural proteins of avian infectious bronchitis virus:role in immunity and protection[J].Adv Exp Med Biol,1993,342:449-453.

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[8]Boot A M,Kuster J G,Van N J M,et al.Localization of a T-cell epitope within the mucleocapsid protein of avian coronavirus[J].Immunology,1991,74(1):8-13.

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