杨小明,赵冬梅,杜秋江,李语如

(1.江苏恒瑞医药股份有限公司 研究所,江苏 连云港 222002;2.连云港职业技术学院,江苏 连云港 222005)

比伐卢定是一种人工合成的二十肽衍生物,为一新型凝血酶抑制剂,与凝血酶的结合是可逆的,大大降低了临时抗凝带来的出血风险,使得该药在高危患者中也得到了广泛的应用,取得了较好的临床应用效果[1]。

在比伐卢定的合成工艺中,为保护比伐卢定的氨基游离而遭受氧化而变质[2],最后一步是将比伐卢定制成三氟乙酸盐,以保证比伐卢定的质量。通过检测比伐卢定中三氟乙酸的含量,来保证其均已成盐(全部成盐后,三氟乙酸理论含量为9.5%)。本实验建立了高效液相色谱法(HPLC)测定比伐卢定中三氟乙酸含量的方法。

1 材 料

比伐卢定,江苏豪森医药股份有限公司研究所提供,批号:20061229、20070213、20070428、20070629;三氟乙酸对照品(色谱纯),美国天地试剂有限公司;甲醇(色谱纯),江苏汉邦科技有限公司;其余试剂均为市售分析纯。

美国Waters Alliance 2695高效液相色谱仪,2487紫外可变波长检测器,Empower 2色谱工作站。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Hanbon Kromasil C18(4.6mm×200mm,5 μ m);流动相:0.07%磷酸溶液(pH 3.0)-甲醇(98∶2);流速:1.0 mL/min;检测波长:210 nm;柱温:30 ℃;进样量 :20 μ L。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液的配制 取三氟乙酸对照品适量,精密称定,加流动相溶解并制成每1 mL中含三氟乙酸500 μ g的溶液,作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的配制 取比伐卢定适量,精密称定,加流动相溶解并制成每1 mL中含比伐卢定5 mg的溶液,作为供试品溶液。

2.3 测定方法

精密量取对照品溶液和供试品溶液各20 μ L,分别注入液相色谱仪。记录色谱图(见图1),按外标法以峰面积计算供试品溶液中三氟乙酸的含量。

图1 比伐卢定中三氟乙酸测定的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of trifluoroacetic acid content in bivalirudin

2.4 加样回收率测定

用加样回收法,精密量取供试品溶液5 mL,置10 mL量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,作为回收试验用空白溶液(三氟乙酸浓度为252.5 μ g/mL),另精密量取三氟乙酸对照品溶液(含三氟乙酸2500 μ g/mL)0.8,1.0,1.2 mL各3份,分别置 10 mL量瓶中,用空白溶液稀释至刻度,摇匀,作为回收率测定溶液,按2.3项方法分别测定,并计算回收率,测定结果见表1。平均回收率为99.9%,RSD(n=9)为0.41%。

表1 回收率试验测定结果表Tab.1 Determination results of recovery rate

2.5 线性范围

取三氟乙酸对照品适量,精密称定,加流动相溶解并分别稀释制成198.4,297.6,396.8,496.0,992.0 μ g/mL的溶液,依次进样20 μ L,记录色谱图,以峰面积(Y)为纵坐标,浓度(X,μ g/mL)为横坐标,进行线性回归。回归方程:Y=557.0 X-4783,r=0.9999,线性范围为 198.4～992.0 μ g/mL。

2.6 精密度测定

取比伐卢定(批号20061229)适量,精密称定,加流动相溶解并制成每1mL中含比伐卢定5mg的溶液,作为供试品溶液,共配制6份,按2.3项方法分别测定三氟乙酸的含量,平均含量为10.3%,RSD为0.56%。

2.7 检测限

取三氟乙酸对照品适量,精密称定,加流动相溶解并稀释制成3.97 μ g/mL的溶液,进行测定,信噪比S/N=3,测得三氟乙酸的检测限为40 ng。

2.8 比伐卢定中三氟乙酸含量测定

取比伐卢定4批(批号:20061229、20070213、20070428、20070629),按2.3项方法测定三氟乙酸的含量,结果分别为10.1%,11.5%,9.6%,10.2%。

3 讨 论

目前三氟乙酸含量测定的方法多采用气相色谱法[3],由于三氟乙酸的极性大,酸性强,对气相色谱柱损伤大,分析成本较高,且效果不很理想。而用氧瓶燃烧法测定氟的含量[4-5],操作繁琐且误差较大。另据报道[2],也可考虑用强酸型阳离子交换色谱柱测定三氟乙酸的含量,本文采用C18色谱柱分离测定比伐卢定中三氟乙酸的含量,方法简便,准确度高。

在三氟乙酸对照品的配制过程中,因三氟乙酸极易挥发,故在称量过程中,量瓶内应先加入适量流动相,再加入三氟乙酸后需充分振摇,使三氟乙酸充分溶解于流动相中,减量法称样比较准确。

在整个试验过程中,比伐卢定主峰未能洗脱出来,多次进样尚未发现其对三氟乙酸测定有干扰,但每次试验完成后,应对色谱柱进行清洗后再保存。

[1]Rhas W,Kuchulakanti P K,Pakala R,et al.Bivalirudin versus heparin as an antithrombotic agent in patientswho undergo percutaneous saphenous vein graft intervention with a distal protection device[J].Am J Cardiol,2005,96(1):67-70.

[2]高春,高恒莹,姚瑛,等.高效液相色谱法测定醋酸奥曲肽中醋酸含量[J].中国生化药物杂志,2004,25(4):237-238.

[3]孟静娟,单风平.气相色谱法测定液相合成蛋酸脑啡肽中杂质残留量[J].微生物学杂志,2008,28(3):106-108.

[4]颜冬梅.人发中微量氟的测定[J].医疗保健器具,2008,15(9):74-75.

[5]张莉,晁若冰.有机药物中残留三氟醋酸测定方法的研究[J].华西药学杂志,2001,16(6):427-428.