李 恒,和七一,余晓东,柳建平,宋锡迅,文浩平,邓疆渝

(重庆市动物生物学重点实验室,重庆市生物活性物质工程研究中心,重庆师范大学 生命科学学院,重庆 400047)

蛇毒是由多种蛋白质、酶类、肽类及小分子物质组成的混合物,并对血凝、纤溶和血小板聚集等发生作用而导致凝血或出血。蛇毒5′-核苷酸酶因可抑制血小板聚集,起到抗凝血作用而受到国内外学者的高度关注。目前,已从多种蛇毒如蝰蛇(Vipera aspis)蛇毒[1]、棕点竹叶青蛇(Trimeresurus gramineus)蛇毒[2]、竹叶青云南亚种(T.stejnegeri yunnanensis)蛇毒[3]、眼镜蛇(Naja naja)蛇毒[4]中检测并分离纯化出了 5′-核苷酸酶。研究发现,不同来源的 5′-核苷酸酶均能抑制血小板聚集,但其抑制血小板聚集的机制有所不同。在前期工作中[5],我们从重庆产的白唇竹叶青(T.albolabris)蛇毒中分离纯化出了5′-核苷酸酶,对其部分性质进行了研究。本文探讨5′-核苷酸酶对血小板聚集的影响及作用机制。

1 材 料

白唇竹叶青蛇毒 5′-核苷酸酶,自制;二磷酸腺苷(ADP),Amresco公司;血小板活化因子(PAF)、花生四烯酸(AA)、磷酸肌酸/磷酸肌酸激酶(CP/CPK)、阿司匹林,Sigma公司;其它试剂均为国产分析纯。

健康家兔,体重(5000±20)g,购于重庆腾鑫生物技术有限公司。

Himac CR22E高速冷冻离心机,日本日立公司;Biologic Duoflow蛋白纯化系统,美国 Bio-rad公司;LBY-NJ4血小板聚集仪,北京普利生仪器有限公司;8500型紫外分光光度计,上海天美科学仪器有限公司;Waters 600高效液相色谱仪,美国Waters公司。

2 方 法

2.1 样品制备

白唇竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶的制备按本实验室方法[5],采用 DEAE-SephadexA-25、Sephadex-G-100和CM-SephadexC-50等3步柱色谱法,从白唇竹叶青蛇毒中分离纯化出了经SDS-PAGE电泳和高效液相色谱检测呈单一条带的组分。蛋白含量按照Lowry法[6]测定。

2.2 富血小板血浆(PRP)制备

健康家兔采用心脏取血,收集于硅烷化的塑料管内,并以3.8%柠檬酸钠抗凝,取血量与抗凝剂的比例为9∶1,立即颠倒充分混匀。用水平离心机1000 r/min离心10 min。待离心机自然停止后取出样本,上层液即为PRP。小心吸取上层液,用血小板计数仪计数其血小板数量,实验中PRP的血小板数调整为50万/mm3左右。

2.3 贫血小板血浆(PPP)的制备

将吸取PRP后剩余血液3000 r/min离心15 min。待离心机自然停止后取出样本,上层无血小板的血浆即为PPP,吸取上层PPP作为测定时对照或用于调整PRP中血小板数。

2.4 洗涤血小板悬液的制备

制备出PRP后,再以3000 r/min离心10 min,沉淀血小板,弃上层血浆。加苔氏洗涤液至原体积洗涤2遍,冲散团块。再离心沉淀后以苔氏悬浮液悬浮供实验用。苔式悬浮液的配制:138 mmol/L NaCl,29 mmol/L KCl,12 mmol/L NaHCO3,0.36 mmol/L NaH2PO4,5 mmol/L葡萄糖,pH 7.4。

2.5 血小板聚集性测定

按Born氏比浊法原理[7],采用LBY-NJ4血小板聚集仪进行测定。取PRP 270 μ L加入聚集管中,试验组分别加入不同浓度的5′-核苷酸酶(25,50,100 μ g/mL)30 μ L,腺苷组加入 100 μ mol/L 腺苷 30 μ L,阿司匹林组加入 100 μ mol/L阿司匹林30 μ L,对照组加入缓冲液30 μ L,孵育5 min,再加入相应的诱导剂ADP(20 μ mol/L)、AA(100 μ g/mL)和 PAF(4.5 nmol/L)各5 μ L。用血小板聚集仪测定5 min的最大聚集率,计算样品对血小板的抑制率。抑制率(%)=(对照最大聚集百分率-加抑制剂最大聚集抑制百分率)/对照最大聚集百分率×100%。

2.6 数据分析

3 结 果

3.1 对ADP、AA、PAF诱导的家兔PRP聚集的影响

结果见表1。白唇竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶对ADP、AA、PAF诱导的血小板聚集具有明显的抑制作用,抑制率与5′-核苷酸酶剂量成正相关。

3.2 对家兔洗涤血小板聚集的影响

结果见表2。在家兔洗涤血小板中,白唇竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶仅对ADP(20 μ mol/L)诱导的血小板聚集有一定的抑制作用(P＜0.01),而对AA(100 μ g/mL)、PAF(4.5 nmol/L)诱导的血小板聚集无明显抑制作用。

表1 白唇竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶对ADP、AA和PAF诱导的家兔PRP中血小板聚集的影响(n=3,)Tab.1 The inhibition of 5′-nucleotidase from T.albolabris venom on rabbit platelet aggregation induced by ADP,AA and PAF(n=3,)

表1 白唇竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶对ADP、AA和PAF诱导的家兔PRP中血小板聚集的影响(n=3,)Tab.1 The inhibition of 5′-nucleotidase from T.albolabris venom on rabbit platelet aggregation induced by ADP,AA and PAF(n=3,)

与对照组比较:1P＜0.05,2P＜0.01Compared with the control group:1P＜0.05,2P＜0.01

组别 剂量 诱导剂 聚集率/% 抑制率/%对照组腺苷组阿司匹林组5′-核苷酸酶组-100μ mol/L 100μ mol/L 25 μ g/mL 50 μ g/mL 100μ g/mL ADP(20 μ mol/L)51.7±7.39.5±0.22 50.1±2.534.1±3.62 30.6±6.92 2.3±1.52-81.7±2.84.0±6.234.1±3.440.9±2.995.6±0.2对照组腺苷组阿司匹林组5′-核苷酸酶组-100μ mol/L 100μ mol/L 25 μ g/mL 50 μ g/mL 100μ g/mL AA(100 μ g/mL)68.2±5.89.4±2.22 5.3±1.62 54.6±8.01 40.9±6.52 26.3±4.32-86.3±3.692.2±3.819.9±4.640.0±3.261.4±2.5对照组腺苷组阿司匹林组5′-核苷酸酶组-100μ mol/L 100μ mol/L 25 μ g/mL 50 μ g/mL 100μ g/mL PAF(4.5 nmol/L)72.3±4.445.7±4.32 70.8±3.357.1±5.61 34.3±3.12 15.7±6.72-36.8±1.62.1±4.221.0±3.852.6±2.278.3±6.3

表2 白唇竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶对ADP、AA和PAF诱导的家兔洗涤血小板聚集的影响(n=3,)Tab.2 The inhibition of 5′-nucleotidase from T.albolabris venom on rabbit washed platelet aggregation induced by ADP,AA and PAF(n=3)

表2 白唇竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶对ADP、AA和PAF诱导的家兔洗涤血小板聚集的影响(n=3,)Tab.2 The inhibition of 5′-nucleotidase from T.albolabris venom on rabbit washed platelet aggregation induced by ADP,AA and PAF(n=3)

与对照组比较:1P＜0.01Compared with the control group:1P＜0.01

组别 诱导剂 聚集率/% 抑制率/%对照组5′-核苷酸酶(100 μ g/mL)ADP(20 μ mol/L)52.4±5.33.2±1.71-93.8±3.2对照组5′-核苷酸酶(100 μ g/mL)AA(100μ g/mL)62.2±3.861.3±2.3-1.4±2.6对照组5′-核苷酸酶(100 μ g/mL)PAF(4.5 nmol/L)72.5±2.265.8±5.2-9.2±4.3

3.3 CP/CPK对家兔PRP血小板聚集的影响

CP/CPK是ADP清除剂,它能抑制ADP(20 μ mol/L)诱导的血小板聚集。对 AA(100 μ g/mL)、PAF(4.5 nmol/L)诱导的血小板聚集无明显抑制作用(图1)。

图1 CP/CPK对不同诱导剂ADP(A)、AA(B)和PAF(C)诱导的家兔PRP血小板聚集的影响Fig.1 The effect of CP/CPK on rabbit platelet aggregations induced by ADP(A),AA(B)and PAF(C)

4 讨 论

近年来发现蛇毒中有许多组分可以直接作用于血小板,发挥促凝和抗凝血作用[8]。其中,蛇毒5′-核苷酸酶通过作用于血小板发挥抗凝血作用。Ouyang等[2]对棕点竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶的研究发现,该酶可以抑制由ADP、AA、胶原蛋白、低浓度凝血酶和Ionophor(A-23187)诱导的血小板聚集。余晓东等[3]发现竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶能抑制ADP、AA、TMVA、凝血酶诱导的血小板聚集。Dhananjaya等[4]报道了眼镜蛇(Naja naja)毒的5′-核苷酸酶具有抗凝血作用。本研究表明白唇竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶对ADP、AA、PAF诱导的家兔PRP的聚集有明显的抑制作用,且抑制率与5′-核苷酸酶剂量呈正相关。

Ouyang等[2]研究发现,棕点竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶水解ADP后的混合物含有ADP、AMP和腺苷等成分,推论5′-核苷酸酶对血小板聚集的抑制作用,除了通过清除血小板聚集诱导剂ADP外,主要与其水解AMP,积累腺苷有关。另外,Packham等[9]报道,在血浆中ADP主要转化成AMP和腺苷,而在血小板悬浮中则主要转化成ATP。在洗涤血小板悬浮液中,白唇竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶仅抑制ADP诱导的血小板聚集,对AA、PAF诱导的血小板聚集无明显的抑制作用,因而推断与洗涤血小板悬浮液中5′-核苷酸酶无法利用血浆中的AMP、积累足够量的腺苷有关。

由于5′-核苷酸酶作用于ADP及AMP的终产物为腺苷。我们用腺苷对家兔血小板进行研究,结果表明腺苷对由ADP、AA。PAF诱导的血小板聚集均有抑制作用。与Born[10]和余晓东等[3]的报道一致。证实5′-核苷酸酶对血小板聚集的抑制作用与腺苷的积累有关。

CP/CPK是ADP清除剂,它能抑制ADP诱导的血小板聚集。白唇竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶与ADP清除系统CP/CPK对血小板抑制作用不同的是CP/CPK仅抑制ADP诱导的血小板聚集,对AA、PAF诱导的血小板聚集无明显抑制作用。而白唇竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶对ADP、AA和PAF等分别诱导的家免PRP血小板聚集均有明显的抑制作用,从而表明白唇竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶抑制血小板聚集不仅通过水解ADP,还可能与其它物质有关。

阿司匹林主要是抑制环氧化酶的作用,能够阻断TXA2的生成和血小板的第二相聚集,从而阻断了血小板聚集的TXA2途径。在用阿司匹林处理由ADP、AA、PAF诱导的家兔PRP的聚集实验中,AA诱导的家兔PSP的聚集受到了明显的抑制,ADP和PAF诱导的家兔PRP的聚集则无明显的抑制作用。这与白唇竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶的抑制作用有所不同,从而表明5′-核苷酸酶抑制血小板聚集还有可能通过阻断TXA2途径,这还有待进一步深入研究。

[1]Boffa M C,Boffa G A.Correlations between the enzymatic activities and the factors active on blood coagulation and platelet aggregation from the venom of Vipera aspis[J].Biochem Biophys Acta,1974,354(2):275-290.

[2]Ouyang C,Huang T F.Inhibition of platelet aggregation by 5′-nucleotidase purified from Trimeresurus gramineus snake venom[J].Toxicon,1983,21(4):491-501.

[3]余晓东,黄立农,熊郁良.竹叶青(Trimeresurus Stejnegeri)蛇毒5′-核苷酸酶对血小板聚集功能的抑制机制研究[J].重庆师范大学学报:自然科学版,1997,14(2):61-68.

[4]Dhananjaya B L,Nataraju A,Rajesh R,et al.Anticoagulant effect of Naja naja venom 5′-nucleotidase:demonstration through the use of novel specific inhibitor,vanillic acid[J].Toxicon,2006,48(4):411-421.

[5]陈夏,余晓东,邓敏,等.白唇竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶的分离纯化及性质[J].动物学研究,2008,29(4):399-404.

[6]Lowry O H,Rosebrough N J,FarrA L,et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent[J].J Biol Chem,1951,193(1):263-275.

[7]Born G V R.Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its recersal[J].Nature,1962,194(4832):927-929.

[8]Oyama E,Takahashi H.Distribution of low molecular weight platelet aggregation inhibitors from snake venoms[J].Toxicon,2007,49(3):293-298.

[9]PackhamM A,Ardlie N G,Mustard J F.Effect of adenosine compounds on platelet aggregation[J].Am J Physiol,1969,217(4):1009-1017.

[10]Born G V R,Cross M J.The aggregation of blood platelets[J].J Physiol,1963,168(1):178-195.