王雪燕,温学森,张 迪,孔晓妮,史 敏

(山东大学 药学院 生药学研究所,山东 济南 250012)

熟地黄(Radix Rehmanniae Praeparata)是一种常用中药材,具有滋阴、补肾和补血活性。中医认为“久病及肾”,因此,熟地黄多用于慢性疾病的治疗。类风湿关节炎属于慢性疑难疾病,中医将其列入“痹症”范畴,而西医认为其属于自身免疫性疾病。其病因与发病机理比较复杂,西医临床上多以糖皮质激素作为一线治疗药物,中医则通常辨证用药,注重标本兼治。

熟地黄常出现在治疗类风湿性关节炎的方剂中[1]。临床观察表明以熟地黄为君药的六味地黄汤对于类风湿性关节炎具有辅助治疗作用[2-3]。动物实验表明六味地黄汤对佐剂性关节炎大鼠的免疫系统具有调节作用[4-5],但其中熟地黄的作用尚不明确。本文用购自Sigma公司的完全弗氏佐剂(Complete Freund′s Adjuvant,CFA)诱发大鼠足趾炎症,以观察熟地黄对该模型是否具有抗炎作用。

1 材 料

健康雄性Wistar大鼠,体重160～200 g,由山东大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(鲁)20030004。

醋酸地塞米松片(0.75 mg/片),山东鲁抗辰欣药业有限公司,批号:080523204;CFA,Sigma公司,批号:068K8729。

熟地黄(购自济南建联中药饮片有限公司)加5倍量水,微沸1 h,取煎液,残渣再煎煮2次,每次加3倍量水,微沸1 h,合并3次煎液,浓缩至每1 mL含原生药0.2 g,分装,-20℃冷冻备用。

2 方 法

2.1 动物分组及给药

大鼠48只随机分为6组:正常对照组,模型组,低、中、高剂量熟地黄给药组和阳性药物组。

引进大鼠后,于实验室适应1周,温度(22±2)℃,相对湿度(50±5)%,光照12 h。正常对照组于大鼠右后足垫皮内注射生理盐水100 μ L,其余各组大鼠注射 CFA 100 μ L。造模后第 19天,熟地黄低、中、高剂量组每天灌胃熟地黄水煎液(5 mL/kg),相当于熟地黄生药0.625,1.250,2.500 g/(kg◦体重),正常对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水,阳性药物组给醋酸地塞米松0.5 mg/(kg◦体重),连续给药10 d。

第19,22,25和28天称量体重,容积法测量右后足趾体积(踝关节以下)。第29天腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,下腔静脉取血,进行红细胞(RBC)、白细胞(WBC)和血小板(PLT)计数,测定血红蛋白含量(HGB)。分离血清,于齐鲁医院生化室检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、葡萄糖(Glu)、肌酐(Cr)、游离血红蛋白(TCH)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量。取胸腺和脾脏称重,计算脏器指数。切取足掌肉垫,福尔马林固定,乙醇梯度脱水,正丁醇透蜡,常规切片,HE染色观察。

2.2 统计学分析

3 结 果

3.1 熟地黄对注射CFA大鼠体重的影响

各组大鼠体重变化如表1。可见,第19天各组体重无显著差异。其后,正常对照组体重增加有所变缓,第25天后又恢复,但与第19天的体重相比,差异均未达显著水平。模型组第25和28天与第19天相比,体重显著增加。熟地黄低、中、高剂量组体重有增加趋势,但与第19天相比差异不显著,其中高剂量组体重增加较少,并于第25和28天显著低于模型组。阳性药物组大鼠体重第19天以后持续下降,与正常对照组和模型组相比,第22,25和28天体重均显著低下。

3.2 熟地黄对注射CFA大鼠足趾体积的影响

注射CFA后,大鼠足趾持续肿胀。给予地塞米松后,足趾体积显著减小,第25和28天与模型组相比,差异达极显著水平,如表2。熟地黄各给药组未显示明显的抗炎作用。

3.3 熟地黄对CFA大鼠免疫器官和血液参数的影响

CFA造模导致大鼠脾脏和胸腺指数显著下降,地塞米松导致胸腺指数进一步降低。低剂量熟地黄使脾脏指数得以恢复,随剂量增加脾脏指数逐渐下降。低和高剂量熟地黄组大鼠胸腺指数恢复到正常水平。

CFA造模组大鼠,除PLT显著下降外,其它血液指标与正常对照组相比,差异不显著。地塞米松可使 PLT 进一步减少 ,RBC、HGB 、WBC 、ALT、Glu、TCH和TG显著增高(如表 3～4),而对AST、AKP、TP、ALB、GLB、HDL和 LDL含量无显著影响(数据未给出)。熟地黄可使血清肌酐含量剂量依赖性增加,高剂量时与模型组相比差异达显著水平。

3.4 足趾肉垫切片

经切片(图1)可见,正常对照组足趾肉垫无炎症细胞浸润,而模型组可见大量淋巴细胞浸润。地塞米松可大幅度降低淋巴细胞浸润的程度,而熟地黄各剂量组均无明显影响。

4 讨 论

本研究中熟地黄给药剂量是依药典和常用临床处方为依据。药典规定熟地黄用药剂量为9～15 g,70 kg人与200g大鼠的体表面积折算系数为0.018,因此折算出大鼠剂量为0.81～1.35 g/kg。我们选用1.25g/Kg作为中剂量,在此基础上减1倍和加1倍分别作为低和高剂量。常用临床处方一般用药量较大,熟地黄一般处方剂量为24 g,折算成大鼠剂量为2.16 g/kg,接近本研究的高剂量。

表1 熟地黄对注射CFA大鼠体重的影响(,n=8)Tab.1 Influence of RRP on body weight of CFA-induced rats(,n=8)

表1 熟地黄对注射CFA大鼠体重的影响(,n=8)Tab.1 Influence of RRP on body weight of CFA-induced rats(,n=8)

与同一天正常对照组相比:1P＜0.05,2P＜0.01;与模型组相比:3P＜0.05,4P＜0.01;与组内19 d相比:5P＜0.05,6P＜0.01 1P＜0.05,2P＜0.01 vs control group;3P＜0.05,4P＜0.01 vs model group of that day;5P＜0.05,6P＜0.01 vs the 19th day in group

组别不同时间体重/g 19 d 22 d 25 d 28 d正常对照组 293.4±22.1 304.4±23.3 302.4±26.6 312.9±26.3模型组 296.0±15.7 307.9±14.5 321.6±19.25 325.3±13.76低剂量组 294.1±28.0 302.4±29.0 309.6±33.9 317.3±35.8中剂量组 288.3±28.1 295.6±28.7 310.1±30.2 317.0±29.5高剂量组 293.0±18.3 299.0±20.0 298.6±22.53 303.5±23.63阳性药物组 299.6±20.1 273.8±23.11,4,5 246.3±18.82,4,5 222.8±19.12,4,6

表2 熟地黄对注射CFA大鼠足趾体积的影响(,n=8)Tab.2 Influence of RRP on foot volume of CFA-induced rats(,n=8)

表2 熟地黄对注射CFA大鼠足趾体积的影响(,n=8)Tab.2 Influence of RRP on foot volume of CFA-induced rats(,n=8)

与同一天模型组相比:1P＜0.01;与组内19 d相比:2P＜0.01 1P＜0.01 vs model group of that day;2P＜0.01 vs the 19th day in group

组别 致炎后不同时间足趾体积/mL 19 d 22 d 25 d 28 d正常对照组 0.76±0.081 0.78±0.061 0.76±0.091 0.78±0.061模型组 1.21±0.15 1.11±0.18 1.12±0.12 1.13±0.13低剂量组 1.24±0.11 1.21±0.10 1.25±0.10 1.27±0.14中剂量组 1.15±0.14 1.13±0.08 1.16±0.16 1.12±0.06高剂量组 1.16±0.14 1.19±0.10 1.18±0.12 1.10±0.10阳性药物组 1.15±0.09 1.00±0.102 0.91±0.091,2 0.93±0.071,2

表3 熟地黄对注射CFA大鼠免疫器官、血红蛋白和血细胞计数的影响( ±s,n=8)Tab.3 Influence of RRP on immune organ,hemoglobin and blood cell counts in CFA-induced rats( ±s,n=8)

表3 熟地黄对注射CFA大鼠免疫器官、血红蛋白和血细胞计数的影响( ±s,n=8)Tab.3 Influence of RRP on immune organ,hemoglobin and blood cell counts in CFA-induced rats( ±s,n=8)

与正常对照组比较:1P＜0.05,2P＜0.01;与模型组比较:3P＜0.05,4P＜0.01 1P＜0.05,2P＜0.01 vs control group;3P＜0.05,4P＜0.01 vs model group

组别 脾脏指数 胸腺指数RBCHGBWBCPLT/[g/(kg◦体重)]/[g/(kg◦体重)]/(1012/L)/(g/L)/(109/L)/(109/L)正常对照组 2.46±0.21 1.36±0.12 7.68±0.32 146.5±9.3 7.20±2.25 980.8±108.0模型组 1.97±0.082 1.08±0.042 7.74±0.45 147.5±12.6 6.98±1.17 866.1±53.11低剂量组 2.40±0.274 1.30±0.154 7.36±0.38 141.0±9.9 7.46±1.45 839.3±119.4中剂量组 2.27±0.223 1.14±0.111 7.70±0.48 153.5±9.6 8.84±1.36 851.1±117.6高剂量组 2.11±0.181 1.35±0.114 7.95±0.56 153.1±9.4 8.77±2.78 933.4±83.93阳性药物组 1.98±0.182 0.14±0.012,4 8.54±0.563 162.3±14.1310.30±3.673 560.7±120.54

表4 熟地黄对注射CFA大鼠血清ALT、Glu、Cr、TCH和TG含量的影响( ±s,n=8)Tab.4 Influence of RRQ on the content of ALT,Glu,Cr,TCH and TG in CFA-induced rats( ±s,n=8)

表4 熟地黄对注射CFA大鼠血清ALT、Glu、Cr、TCH和TG含量的影响( ±s,n=8)Tab.4 Influence of RRQ on the content of ALT,Glu,Cr,TCH and TG in CFA-induced rats( ±s,n=8)

与模型组比较:1P＜0.05,2P＜0.01 1P＜0.05,2P＜0.01 vs model group

组别 ALT/(u/L) Glu/(mmol/L) Cr/(μ mol/L) TCH/(mmol/L) TG/(mmol/L)正常对照组 43.4±6.0 4.980±1.010 51.70±4.34 1.280±0.123 0.716±0.305模型组 41.9±5.0 5.120±1.076 47.45±7.59 1.260±0.217 0.755±0.446低剂量组 46.0±5.7 8.357±0.4332 50.29±4.11 1.096±0.184 0.739±0.224中剂量组 58.9±13.52 5.569±1.279 53.48±4.60 1.258±0.160 0.723±0.236高剂量组 48.0±7.3 6.207±1.517 61.17±10.651 1.175±0.125 0.510±0.049阳性药物组 96.6±10.52 7.689±1.1182 47.57±2.70 2.029±0.5642 1.641±0.6822

图1 大鼠足趾肉垫切片,HE(×40)Fig.1 The cross section of rat paw,HE(×40)

用于复制大鼠佐剂性关节炎的CFA通常每1 mL含有灭活结核分枝杆菌或卡介苗10 mg作为抗原,需自行配制。材料来源和制备技术显著影响实验的成功率。近年来,灭活结核分枝杆菌或卡介苗均难以购买,影响了该模型的应用。本研究采用Sigma公司的CFA,但其分枝杆菌含量为1 mg/mL。Kumar和Roy曾用该产品诱导大鼠单侧关节炎[6]。

Mythilypriya等[7]制备的佐剂性关节炎大鼠存在多种血液指标异常,本文选择其报道有显著差异的16个指标进行了检测,发现模型组仅有PLT显著减少,而非增加,其他指标未见显著变化。一般认为佐剂性关节炎是一种迟发性超敏反应,以淋巴细胞活化为主[8]。虽然本文切片也见大量淋巴细胞浸润,但实验期间未见继发病变和体重下降。因此,用Sigma公司的CFA诱导的大鼠足趾炎症与文献报道的佐剂性关节炎尚有较大差距,抗原剂量不足可能是主要原因。不过本文用该产品诱导的大鼠足趾肿胀可保持4周以上,其应属于慢性炎症。

地塞米松可显著减轻CFA诱导的大鼠足趾肿胀,说明该模型对糖皮质激素敏感。不过地塞米松同时导致多种毒副作用,如胸腺萎缩,RBC、WBC、HGB、ALT、Glu、TCH 和TG 显著升高,PLT显著下降。给予地塞米松后,大鼠体重显著降低,与文献报道[9-10]一致,可能与其糖异生作用有关,其使蛋白质、脂肪等分解转化为葡萄糖,致使体重下降,血糖增高。

尽管临床上熟地黄可用于多种慢性炎症的治疗,并认为其具有糖皮质激素样作用[11],但本文发现熟地黄对该炎症模型无消炎作用,说明熟地黄的作用机制不同于糖皮质激素。在某些方面熟地黄的影响与地塞米松相反,如胸腺指数和血小板计数等,这提示临床上用糖皮质激素治疗类风湿性关节炎等慢性炎症时,熟地黄或含熟地黄的方剂可用于减轻其毒副作用[2-5]。

总之,Sigma公司的CFA确实可以诱导大鼠足趾长期肿胀,肿胀部位有大量淋巴细胞浸润,该炎症对地塞米松敏感,而熟地黄影响不显著,提示二者的作用机制不同。熟地黄在类风湿性关节炎治疗中可能主要起辅助作用,如缓解患者的肾阴虚症状等。

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[5]方鉴,张永祥,茹祥斌,等.六味地黄汤对佐剂性关节炎大鼠脾脏细胞表达细胞因子的影响[J].中国中药杂志,2001,26(2):128-131.

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