张 振,法萍萍,李金龙,胡志明,高基民

(南方医科大学 生物技术学院 生物治疗研究所,广东 广州 510515)

肿瘤疫苗是目前最具吸引力的肿瘤治疗方法,通过基因修饰或细胞表面锚定修饰技术将具有免疫调节作用的细胞因子修饰肿瘤细胞制成新型肿瘤细胞疫苗,是肿瘤疫苗研究的新策略。白介素4(Interleukin-4,IL-4)又名B细胞生长因子,对多种肿瘤具有抑制作用。包括诱导宿主的抗肿瘤免疫反应,抑制肿瘤血管生成[1-2]。链亲和素(Streptavidin,SA)是由亲和素链霉菌产生的非糖基化同源四聚体蛋白。它能与生物素紧密非共价结合,由于SA可与生物素快速且几乎不可逆的强力结合,以及生物素较容易掺入各种生物分子(如蛋白质,核酸和脂多糖)中,即生物素化,故SA-生物素间的强力作用可用于生物医学的许多领域[3]。本文研制的SA标记的鼠IL-4(mIL-4-SA)双功能融合蛋白,通过生物素和SA的高效结合,把蛋白直接锚定于生物素化的肿瘤细胞表面,可持续维持mIL-4在肿瘤局部的有效浓度。另外,也可以将融合蛋白锚定于灭活肿瘤细胞表面,制备肿瘤疫苗,以便产生更为有效的抗肿瘤免疫反应[4]。本文对mIL-4-SA基因克隆,融合蛋白表达纯化,复性及其生物学功能进行了初步研究,为研制IL-4表面锚定修饰的新型肿瘤细胞疫苗打下了基础。

1 材 料

1.1 菌株及细胞

菌株 E.coli BL21(DE3)、DH5α购自北京鼎国公司;SA-pET21质粒为本室保存;小鼠黑色素瘤细胞B16F10、亲和素链霉菌购自ATCC。

1.2 试剂

各种限制性内切酶均购自 Promega公司;Ni-NTA螯合色谱填料购自Qiagen公司;偶联辣根过氧化物酶(HRP)的羊抗兔IgG购自北京鼎国公司;Western blotting检测试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司;兔抗鼠IL-4单抗购自Merck公司;硝酸纤维素膜购自PALL公司;mIL-4标准品购自Peprotech公司。

2 方 法

2.1 目的基因及引物设计

提取ConA活化的小鼠脾细胞的RNA,逆转录cDNA为模板,设计上游引物 CCCATATGCATATCCACGGATGCGACAA(NdeⅠ酶切位点),下游引物CGGAATTCCGAGTAATCCATTTGCATGA(EcoRⅠ酶切位点),加入PCR相关试剂进行循环,反应条件:94℃预变性3 min,94℃变性45 s,55℃复性45 s,72℃延伸45 s,30个循环后72℃延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳观察结果。

2.2 重组质粒的构建、筛选和鉴定

将PCR产物进行切胶回收,双酶切,SA-pET21质粒进行双酶切,切胶回收空载体。T4DNA连接酶16℃连接过夜,转化DH5α感受态细胞,于卡那霉素平板培养基上过夜培养,挑取单克隆菌落加入T7上游引物和mIL-4下游引物行PCR鉴定,阳性者提取质粒,进行酶切鉴定,鉴定正确送质粒测序。

2.3 重组蛋白的表达

将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21,接种于LB液体培养基5 mL中,培养至吸光度(A)值为0.4～0.6时,IPTG诱导,表达情况用12%SDS-PAGE鉴定。挑取表达高的菌落进行大量培养诱导,收集菌体,12%SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。

2.4 包涵体的提取

按1∶10应用菌体裂解液重悬菌体,4℃搅动30 min,冰浴中超声20 s×10次(间隔 30 s),超声破碎后,4℃,12000×g离心30 min,收集沉淀。按1∶10依次用洗涤液A(20 mmol/L Tris-HCl,2 mmol/L EDTA,pH 8.0)、洗涤液B(20 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L EDTA,2 mmol/L巯基乙醇,0.1%TritonX-100,pH 8.0)、洗涤液C(20 mmol/L Tris-HCl,2 mol/L尿素,2 mmol/L EDTA,pH 8.0)、洗涤液D(20 mmol/L Tris-HCl,2 mmol/L EDTA,50%异丙醇,pH 8.0)、洗涤液E(20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0)洗涤包涵体。12000×g离心15 min,沉淀为包涵体。

2.5 mIL-4-SA的纯化

将包涵体用50 mmol/L磷酸钠缓冲液(含8 mol/L尿素,5 mmol/L巯基乙醇)溶解,4℃搅动30 min。12000×g离心15 min,取上清上样于Ni-NTA,用平衡液(50 mmol/L磷酸钠缓冲液,8 mol/L尿素)冲洗至样品A280恢复至基线,分别应用不同浓度的咪唑溶液进行洗脱,收集洗脱峰,12%SDS-PAGE检测纯化情况。

2.6 融合蛋白的复性

将蛋白浓度调整至0.1～0.2 mg/mL,在大于20倍体积的透析液(20 mmol/L Tris-HCl,4 mol/L尿素,1 mmol/L还原型谷胱甘肽,0.1 mmol/L氧化型谷胱甘肽,1 mmol/L EDTA)4℃透析复性,逐渐降低尿素浓度,每12 h换液1次,最终换用pH 7.4磷酸盐缓冲液透析12 h,离心除去不溶物,收集上清。

2.7 Western blotting鉴定

12%SDS-PAGE分离蛋白,利用半干电转仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。用5%脱脂奶粉于37℃封闭2 h后,加入兔抗鼠IL-4单克隆抗体,37℃孵育1 h,加入偶联HRP的羊抗兔IgG,37℃孵育1 h,洗涤后用DAB试剂盒显色。

2.8 mIL-4-SA生物学活性测定

制备C57小鼠胸腺细胞悬液,用含 1 μ g/mL ConA的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为1×107/mL。于96孔培养板中每孔加入胸腺细胞悬液100 μ L,分别加入一系列稀释的mIL-4-SA融合蛋白和mIL-4标准品,每孔设3复孔。于37℃,5%CO2孵箱培养48 h,采用MTT法测定细胞增殖。因mIL-4-SA的相对分子质量(Mr)为mIL-4的2倍,mIL-4-SA融合蛋白的初始浓度为200 ng/mL,IL-4标准品的初始浓度为100 ng/mL,其活性为2×106U/mg。

2.9 流式细胞仪检测mIL-4-SA对肿瘤细胞的修饰效果

取生长状态良好的B16F10细胞,调节细胞浓度为5×106/mL,加入Sulfo-NHS-LC-Biotin使其终浓度为1 mg/mL,37℃反应30 min,加入mIL-4-SA作用60 min,洗涤细胞后加入兔抗鼠IL-4单克隆抗体,37℃作用30 min后洗涤细胞2次,加入FITC标记的羊抗兔 IgG 10 μ L,室温避光 30 min,洗涤后取洗液 100 μ L重悬细胞,流式细胞仪检测,分析mIL-4-SA对肿瘤细胞的修饰效果。

3 结 果

3.1 重组质粒酶切鉴定

结果见图1。重组质粒应用限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ进行双酶切,获得与预期大小一致的片段。经核苷酸序列测定,准确无误。

图1 重组mIL-4-SA-pET21的酶切鉴定Fig.1 Identification of resultant expression plasmid mIL-4-SA-pET21

3.2 mIL-4-SA融合蛋白的表达纯化和复性

将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,经筛选获得表达工程菌,SDS-PAGE显示(图2),在Mr32200处有蛋白条带,而未经诱导的工程菌在此处未见蛋白条带,薄层扫描分析,目的蛋白占总蛋白的35%。工程菌经大规模培养诱导,超声裂解后,目的蛋白主要存在于包涵体中,用Ni-NTA纯化,经透析复性,可获得有活性的融合蛋白。

3.3 Western blotting鉴定

结果证实,制备的mIL-4-SA融合蛋白能与IL-4单克隆抗体结合,发生显色反应(图3)。

3.4 生物学活性测定

用小鼠活化胸腺细胞增殖法测定融合蛋白的生物学活性,以 mIL-4标准品为对照(图 4)。经SPSS13.0软件进行统计学分析,两者的生物学活性无显著性差异(P＞0.05)。融合蛋白的活性为1×106U/mg。

3.5 流式细胞仪检测

用兔抗鼠IL-4单克隆抗体及FITC标记的羊抗兔IgG对锚定在生物素化的B16F10表面上mIL-4-SA融合蛋白进行流式细胞仪检测,左峰为未修饰的细胞(阴性对照),而右峰为锚定修饰的细胞(图5)。结果显示mIL-4-SA融合蛋白的锚定率为96.69%。

4 讨 论

新型肿瘤疫苗是肿瘤生物治疗研究的热点,将具有免疫调节作用的细胞因子通过基因修饰或细胞表面锚定技术修饰肿瘤细胞制成疫苗是肿瘤疫苗研究的新策略。由于基因转染存在转移效率低以及病毒载体的潜在安全性问题,难以在临床上广泛应用。

图5 mIL-4-SA对生物素化的B16F10细胞锚定的流式细胞检测Fig.5 Modified rate of mIL-4-SA on biotinylated B16F10 cells by FACS

近年来,我们利用细胞膜表面易生物素化和生物素与SA高效而超强结合这两个特性建立了细胞膜表面锚定修饰技术平台,使具有免疫佐剂作用的细胞因子锚定在肿瘤细胞表面,以增强肿瘤疫苗诱导机体主动免疫的效果。我们研制的SA-GM-CSF融合蛋白对黑色素瘤细胞进行锚定修饰制成的肿瘤疫苗,获得了良好的动物实验效果[4]。

IL-4传统上被认为是诱导体液勉疫应答的细胞因子。但近年来的研究发现其在体内外均有抗肿瘤作用,IL-4基因导入肿瘤,可以降低其致瘤性,实验证实应用IL-4转染肿瘤细胞制备疫苗,可以导致肿瘤的缩小,这种作用通过天然免疫和特异性免疫应答实现[5-7],应用IL-4转染神经胶质瘤细胞,皮下预防接种,能够有效抑制大鼠颅内胶质瘤的生长,延长其生存期[8-9]。因此,IL-4在肿瘤的治疗中有良好的前景。本文制备了mIL-4-SA融合蛋白,希望通过生物素和SA的结合,将IL-4直接锚定于生物素化的肿瘤细胞表面,制备肿瘤疫苗,以提高疫苗的抗肿瘤效应。目前,相关的动物实验正在进行中。

本文成功构建了mIL-4-SA-pEt21的质粒,在构建过程中,在IL-4和SA间引入甘氨酸、丝氨酸的连接肽(17肽),有助于融合蛋白中各单元蛋白质分子的独立折叠,从而保存各自的生物活性。设计中引入组氨酸标签,利用二价阳离子与组氨酸结合的性质,用一步螯合色谱即可将表达的蛋白纯度提高至95%,纯化方法简单、效率高。由于融合蛋白为包涵体表达,且IL-4中含有6个半胱氨酸,因此,复性成为难点。本文在复性过程中加入谷胱甘肽,精氨酸,有利于蛋白质的正确折叠。实验结果显示,本文研制的mIL-4-SA融合蛋白具有双功能活性,即能够锚定于生物素化的肿瘤细胞表面,锚定率达96.69%,且同时具有IL-4的活性。在初步的动物实验中显示出高效的抗肿瘤功能。IL4-SA融合蛋白的研制有可能为肿瘤治疗提供一种新的方法。

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